一种水稻基因OsAP2‑6及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种水稻基因

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程
更具体涉及一种水稻基因0SAP2-6,同时还涉 及一种水稻基因0sAP2-6的制备方法，还涉及一种水稻基因0sAP2-6的用途。
技术介绍
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，经历了矮化育种和杂种优势利用这两个阶 段后，水稻单产在有了很大的飞跃，长期的高产目标使得对稻米品质的重视不够，近年来， 在保持_广的基础上进一步提升水稻品质成为主要目标。 水稻品质王要分为加工品质、外观品质、蒸煮食味品质以及宫养品质，其中外观品 质中的粒型尤为重要，粒型一般用粒长、粒宽、长宽比以及谷粒面积来表示，粒型对外观品 质和产量的影响很大，因此，科学家们对水稻粒型的遗传研究较为深入，目前已经克隆了包 括 GS3、GW5/qSW5、GS5、GW8 和 qGL3. 1 等主效基因（Fan et al.，2006 ;Song et al.，2007 ; Ayahiko et al.，2008 ;Weng et al.，2008 ;Li et al.，2011 ;Wang et al.，2012 ;Zhang et al.，2012)。其中除了 GS5正调控粒型外，其余几个基因均负调控粒型，而且GW2、qSW5/GW5 和GW8对粒型和产量的效应相反，即增加产量会降低品质，因此发掘新的粒型基因对改良 稻米外观品质尤为重要。 在高产目标的驱动下，化肥的大量使用不仅使水稻对土壤肥料的利用效率下降， 增加生产成本，而且会造成土壤板结、环境污染，因此，培育新品种、改良水稻的根系以增强 水稻对土壤营养物质的吸收利用，成为低投入、高产出、保护环境的主要手段。水稻根系属 于须根系，由种根、冠根和侧根组成，其中冠根是水稻固着、吸收养分和水分的主要器官，是 决定水稻产量的重要因子。因此，增加根系的冠根数目是改良水稻对土壤营养物质吸收利 用的一种方法。目前，水稻冠根发生发育的相关基因和机制并不清楚。通过筛选水稻突变体鉴定 到几个影响冠根发育的基因。Crown rootlessUcrll)基因由于一个碱基的替换导致其编 码的蛋白的改变，影响生长素的信号转导，使得冠根原基不能发生，从而抑制的冠根的发生 (Inukai et al.，2005);W0Xll参与了生长素和细胞分裂素的信号转导过程，它的T-DNA插 入突变体表现为冠根发生受到抑制（Zhao et al.，2009)，CROWN R00TLESS5 (CR15)同样也 参与生长素和细胞分裂素的信号转导，突变体crl5由于该基因突变导致编码氨基酸提前 终止、功能丧失，冠根不能发生（Kitomi et al.，2011)。这些突变体都是功能缺失型，基因 突变导致功能丧失，严重抑制冠根发生；还未发现冠根数目增加的突变体。目前通过筛选突 变体可能很难获得理想根系的材料。应用基因工程的手段可以调控水稻体内目标基因的表 达，调控植物地下冠根的形成和发育，但水稻冠根发生发育的相关目标基因较少。 本专利技术的目的是克隆一个影响水稻根系和粒型的基因0SAP2-6,利用该基因的编 码序列（CDS)，构建该基因的超表达载体转化水稻，获得改良粒型的材料；利用水稻基因 0sAP2-6的一段cDNA片段，构建0sAP2-6抑制表达载体转化水稻，创造增加水稻冠根数目， 提高植物生物量的改良新材料。 本专利技术在国内外未见报道，所在课题组也未公开发表涉及本
技术实现思路
的文章，本 专利技术在国内外公众未知。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种水稻基因0sAP2-6,该基因可以增加水稻品种中 花11的谷粒长度和宽度，可以增加水稻品种中花11的冠根数目和生物量。 本专利技术的另一个目的是在于提供了一种水稻基因0sAP2-6的制备方法，利用聚合 酶链式反应（PCR)扩增得到基因0sAP2_6,该方法简便，快捷，可行。 本专利技术的再一个目的是在于提供了一种水稻基因0SAP2-6在改良水稻品种珍汕 97B的粒型及根系中的应用，利用来源于日本晴和ACC10的0sAP2-6基因可以增加水稻品种 珍汕97B的粒型、根系和生物量。 为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施： 一种水稻基因0SAP2-6及其制备方法，其步骤是： 1、利用聚合酶链式反应（PCR)从水稻品种6W039 (来源于国际水稻研究所，编号： IR65482-4-136-2-2,见遗传资源披露表）中扩增得到基因0sAP2-6,基因全长5791个碱基， 包括1786个碱基的启动子，3365个碱基的基因以及640个碱基的基因下游序列，所示的核 苷酸序列SEQ ID N0. 1。基因的编码序列（⑶S)由1407个碱基组成，所示的核苷酸序列SEQ ID N0. 2,编码469个氨基酸，所示的氨基酸序列SEQ ID N0. 4。 2、将步骤1中得到的基因0sAP2-6的CDS (SEQ ID NO. 2)与超表达载体PU1301 (Zhao Y et al.，2009)连接，构建0sAP2_6超表达载体； 3、将基因0sAP2-6的一段262个碱基的cDNA，其编码为SEQ ID NO. 3所示的核苷 酸序列（片段）与抑制载体PDS1301 (Chu ZH et al.，2006)连接构建0sAP2-6抑制表达载 体； 4、利用根癌农杆菌EHA105 (购于Takara公司，公开产品）介导的转基因方法将超 表达和抑制载体导入水稻品种中花11 (中国公开品种）中，获得转基因植株； 5、利用聚合酶链式反应（PCR)对步骤4产生的T0代超表达转基因植株进行阳性 检测，通过半定量PCR (RT-PCR)检测阳性转基因植株中0sAP2-6的表达，选择0sAP2-6表 达量显著升高的转基因植株，收获单株自交种子； 6、将步骤5选留的转基因植株的种子种成T1代家系，继续利用PCR对T1代单株 进行阳性检测，利用RT-PCR对阳性单株检测转入片段的表达，考察阳性转基因单株和对照 (CK)野生型中花11的粒型，阳性转基因植株谷粒长度和宽度与对照相比均显著增大，结合 田间表现选择表现优良的转基因单株，自交留种； 7、继续种植步骤6中选留的目标单株成T2代家系，利用PCR对T2代单株进行阳 性检测，对阳性单株和对照进行粒型考察，阳性转基因植株谷粒长度和宽度与对照相比均 显著增大，从中选择农艺性状有较大改善的纯合单株，自交留种； 8、利用PCR对步骤4产生的T0代抑制表达转基因植株进行阳性检测，通过RT-PCR 检测阳性转基因植株中0sAP2-6的表达，选择0sAP2-6表达量显著下降的转基因植株，收获 单株自交种子； 9、将步骤8选留的转基因植株的种子种成T1代家系，继续利用PCR对T1代单株进 行阳性检测，利用RT-PCR对阳性单株检测转入片段的表达，考察植株生长30天后阳性转基 因单株和对照（CK)野生型中花11的冠根数和植株生物量，阳性转基因植株的冠根数目、地 上部苗干重和千粒重与对照相比均显著增加，结合田间表现选择表现优良的转基因单株， 自交留种。 该基因0sAP2_6所编码蛋白的分子量为50117道尔顿，富含丙氨酸（13%)、甘氨酸 (10. 9%)和丝氨酸（11. 1%);脂肪系数为56. 09 ;等电点为6. 43 ;疏水指数为-0. 536,表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的水稻基因OsAP2‑6，其编码为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余四斌，孙文强，高大伟，王重荣，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42