本发明专利技术公开了一种脂肪原始间充质干细胞的增殖培养方法，包括以下步骤：将分离的单个干细胞接种于培养瓶，加入无血清培养基，细胞培养24小时首次全量换液；然后继续采用无血清培养基进行细胞培养。无血清培养基不引入外源蛋白质，使培养的细胞利于临床应用，培养24小时首次全量换液，能够充分去除残余杂细胞，有利于纯化干细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养领域，特别涉及一种脂肪原始间充质干细胞的增殖培养方 法。
技术介绍
干细胞是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细 胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为胚胎干细胞，多能干细胞以及 各种组织中的定向干细胞如造血干细胞、神经干细胞等。目前，已有利用干细胞治疗心肌梗 塞、红斑狼疮、类风湿性关节炎、神经损伤、肌肉萎缩等的实验报道。 成体干细胞是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种原始干细胞群，在特定 环境下可诱导分化成多种组织细胞。在成体干细胞中，间充质干细胞广泛存在于全身各种 组织中，特别是骨髓，脂肪，脐带和胎盘。由于脂肪来源的间充质干细胞具有强大的增值能 力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关 注。 中国专利ZL201210336264. 5公开了一种"人脂肪干细胞的分离培养方法和干细 胞库的构建方法"，该方法在进行细胞培养时，培养较长时间才首次换液，不利于纯化干细 胞，且其在培养基中加入了高浓度的胎牛血清，增加了培养成本，也引入了外源动物蛋白， 使培养的细胞不利于临床应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利于纯化干细胞、不引入外源蛋白质、有利于临床应用 的。 为实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种脂肪原始间充质干细胞的 增殖培养方法，包括以下步骤：将分离的单个干细胞接种于培养瓶，加入无血清培养基，细 胞培养24小时首次全量换液；然后继续采用无血清培养基进行细胞培养。由此，无血清培 养基不引入外源蛋白质，使培养的细胞利于临床应用，培养24小时首次换液，能够充分去 除残余杂细胞，有利于纯化干细胞。 在一些实施方式中，将干细胞接种于无血清培养基时加入庆大霉素。由此，庆大霉 素是一种氨基糖苷类抗生素，主要用于治疗细菌感染，尤其是革兰氏阴性菌引起的感染。 庆大霉素能与细菌核糖体30s亚基结合，阻断细菌蛋白质合成。庆大霉素与其他抗生素相 比（头孢类，青霉素类）具有良好的热稳定性，较低的过敏人群等优点。 在一些实施方式中，无血清培养基由基础培养基和添加物组成，基础培养基为 DMEM/F12,添加物包含：血清替代物2~15% (v/v)、维生素C20~100ug/ml、人干细胞生长 因子0? 5~10ng/ml、人血小板源生长因子5~20ng/ml、L_谷氨酰胺1~5mmol/ml。由此， 无血清培养基的各组分能够为细胞培养提供良好的条件，使培养脂肪源的间充质干细胞具 有细胞周期短、增殖能力强、细胞均一性好、纯度高的特点，有效的抑制干细胞的分化和内 皮细胞的贴壁生长，保证干细胞的纯度和干性，另外该培养基不含胎牛血清等动物源成分， 通过该培养基获得的干细胞适合于临床应用。 在一些实施方式中，无血清培养基由基础培养基和添加物组成，基础培养基为 DMEM/F12,添加物包含：血清替代物5% (v/v)、维生素C50ug/ml、人干细胞生长因子2ng/ ml、人血小板源生长因子20ng/ml，L-谷氨酰胺2mmol/ml。由此，上述无血清培养基的组分 含量能够使细胞具有最优的增殖效果。 在一些实施方式中，，包括以下步骤： 将分离的单个干细胞以0. 5~IX104/cm2的密度接种于培养瓶内，加入无血清培 养基，然后置于37°C、饱和湿度、C02体积分数为5 %的培养箱内培养； 细胞培养24h后换液，去掉残余的血细胞和杂细胞，继续培养，每三天全量换液； 待细胞达到80 %~90 %融合度，用0.9%的生理盐水洗涤细胞表面，加入 0. 075 %~0. 125% (m/v)的胰蛋白酶进行消化； 将消化后的细胞转移到离心管内，1200~1800rpm，离心6~8min，将离心所得的 沉淀用无血清培养基重悬，按1 :3的比例接种进行传代培养，将P1代细胞进行检测和冻存。 由此，上述细胞增殖培养步骤简单、花费时间短，能够有效纯化干细胞，保证干细 胞的纯度和干性，获得的干细胞适合于临床应用。 在一些实施方式中，将干细胞接种于无血清培养基时加入200IU庆大霉素。由此， 上述剂量的庆大霉素具有良好的抗菌效果。 本专利技术的有益效果为：本专利技术的无血清培养基能够使培养的脂肪源的间充质干细 胞具有细胞周期短、增殖能力强、细胞均一性好、纯度高的特点，有效的抑制干细胞的分化 和内皮细胞的贴壁生长，保证干细胞的纯度和干性，另外该培养基不含胎牛血清等动物源 成分，通过该培养基获得的干细胞适合于临床应用。本专利技术细胞培养24小时首次换液，能 够充分去除残余杂细胞，有利于纯化干细胞。采用庆大霉素为接种细胞的抗菌，与其他抗生 素相比（头孢类，青霉素类）具有良好的热稳定性，较低的过敏人群等优点。【附图说明】 图1为本专利技术的实施例1的步骤S2中细胞培养24h后显微镜观察照片； 图2为本专利技术的实施例1中细胞培养过程中的显微镜观察照片，其中，图2A为 细胞培养首次达到80%~90%融合度后的显微镜观察照片，图2B为细胞培养首次达到 80%~90%融合度后细胞计数照片；图2C为P1代细胞显微镜观察照片； 图3为本专利技术的实施例1中获得细胞流式检测结果； 图4为本专利技术的实施例2中细胞培养过程中的显微镜观察照片，其中，图4A为 细胞培养首次达到80%~90%融合度后的显微镜观察照片，图4B为细胞培养首次达到 80%~90%融合度后细胞计数照片；图4C为P1代细胞显微镜观察照片； 图5为本专利技术的实施例2中获得细胞流式检测结果； 图6为本专利技术的实施例3中细胞培养过程中的显微镜观察照片，其中，图6A为 细胞培养首次达到80%~90%融合度后的显微镜观察照片，图6B为细胞培养首次达到 80%~90%融合度后细胞计数照片；图6C为P1代细胞显微镜观察照片；图7为本专利技术的实施例3中获得细胞流式检测结果； 图8为本专利技术的实施例4中细胞培养过程中的显微镜观察照片，其中，图8A为 细胞当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
脂肪原始间充质干细胞的增殖培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将分离的单个干细胞接种于培养瓶，加入无血清培养基，细胞培养24小时首次全量换液；然后继续采用所述无血清培养基进行细胞培养。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴炯，
申请(专利权)人：厦门中领精准医学产业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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