本发明专利技术公开了一种地龙蛆虫蛋白质的制备方法及其在制备抗骨肉瘤药品中的应用，所述制备方法如下：将地龙蛆虫在常温膨化装置中膨化粉碎；然后加入到膨胀溶剂体系提取装置中提取出地龙蛆虫蛋白质粗品；收集含有地龙蛆虫蛋白质粗品的溶液并用微孔过滤器过滤去掉杂质；用超滤机超滤处理，收集地龙蛆虫蛋白质超滤溶液；超滤液溶解在乙腈中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分；将洗脱成分溶解在溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱分离纯化；用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉，可用于制备抗骨肉瘤药品。本发明专利技术制备的地龙蛆虫蛋白质制剂质量稳定，结构清楚，药理明晰，疗效明显，含量可检可测，剂型多样，成本较低，适合工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种药物的制备方法及其新用途，尤其是地龙蛆虫蛋白质的制备方法 及其在制备抗骨肉瘤药品中的应用。
技术介绍
骨肉瘤由肉瘤性骨母细胞及其产生的骨样组织和骨小梁构成，为常见的骨恶性肿 瘤之一。目前公认的对骨肉瘤应采用综合治疗，早期患者可以手术的一般需作术前化疗或 放疗，以后手术截肢或全骨切除加入人工骨植换，术后需联合化疗几个疗程以巩固疗效，消 灭可能残存的微小病灶。转移病人不能做手术的患者，一般先做化疗，以后视情况加以手术 或放疗。 中医根据病症的情况，将患者病症划分为阴塞凝滞、蚀骨阻络型，毒热蕴结、气滞 血瘀型，肾精亏虚、毒瘀痰结型，对症下药，分类治疗。 CN102532261A公开了骨重建激活剂-酪脯肽及其药物组合物和用途。该专利技术对成 骨生长肽C端五肽的结构改造而发现的一类具有激活骨重建活性的酪脯肽化合物，可望发 展成一种改善骨质量的药物。 CN103304635A公开了一种环肽类化合物抗肿瘤的应用及其制备方法，该专利技术涉及 环肽类化合物的制备方法以发酵生成产物并进行分离得到具有活性的环肽类化合物。 CN103272221A公开了 WSB-I蛋白在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。该专利技术描述 了 WSB-I蛋白在制备治疗骨肉瘤的药物或诊断骨肉瘤和预测骨肉瘤转移的产品中的应用， 该药物包括用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断骨肉瘤和预测骨 肉瘤转移的产品。 CN103041366A公开了一种骨肽组合物及其制备方法，该组合物以骨肽化合物、氨 基酸、核酸、游离脂肪酸等组成。 CN102053150A公开了一种人成骨肉瘤干细胞相关抗原标记物及其应用。该专利技术描 述一种人成骨肉瘤干细胞相关抗原标记物SSEA-4及其在成骨肉瘤靶向治疗中的应用。 CN102792927A公开了人工培育地龙蛆虫的工艺，该专利技术描述了以中药地龙等为原 料，经过粉碎、糊化、灭菌、培殖生成地龙蛆虫，通过一种温和简单方式转换生成的地龙蛆虫 消除了地龙易引起的副作用，同时提高了地龙的药用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种地龙蛆虫蛋白质的制备方法及其在制备抗骨肉瘤药品 中的应用，本专利技术工艺过程中采用适宜的方法提取分离地龙蛆虫蛋白质，并根据地龙蛆虫 蛋白质的特性辅以相应的材料至制备成不同剂型的药剂。 本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的： (1)将1000 g地龙蛆虫在常温膨化装置（200520108339. X)中常温条件下膨化粉碎。 本步骤中，所述膨化压力为0? l~5MPa，时间为10~60min。 (2)膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中，加入 膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出地龙蛆虫蛋白质粗品。 本步骤中，所述膨胀溶剂由]-IOKg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 ? H2O组成或由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组 成。 本步骤中，所述提取温度为10~20°C，时间为10~30min。 (3)收集含有地龙蛆虫蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。 本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0. 5~50Mm。 (4)用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的地龙蛆虫蛋白质超滤溶液。 本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。 (5)超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。 本步骤中，所述溶剂为乙腈。 (6)将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱 (200920274485. 8)分离纯化。 本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)组成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）组成。 (7)纯化后的地龙蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。 本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为_30~50°C、时间为18~26h。 (8)赋予不同的药用辅助材料，分别制备成注射剂、口服剂、栓剂等，可用于制备抗 骨肉瘤药品。 本专利技术的优点和有益效果如下：通过本专利技术分离纯化的地龙蛆虫蛋白质 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为 11. 8~12. 6KPa;用等电聚焦法测定其等电点为pH9. 6~10. 7;常规化学法分析结果表明其不 含糖类和磷酸基团；紫外分光光度法分析在260nm和280nm测定纯化的地龙蛆虫蛋白质含 量为98. 2%;分子结构属非典型、非单一的昆虫蛋白质，链内与链间不含二硫键，其三级结 构构象单元以无规卷曲为主，a螺旋与e折叠的含量比例基本相当。本专利技术制备的地龙 蛆虫蛋白质制剂质量稳定，结构清楚，药理明晰，疗效明显，含量可检可测，剂型多样，成本 较低，适合工业化生产。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对 本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵 盖在本专利技术的保护范围中。 实施例1: (1)将1000 g地龙蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，地龙蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的地龙蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ? H2O,加压至2~10MPa，形成膨 胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，地龙蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压 至常压，生成地龙蛆虫蛋白质粗品与甲醇-NH 3 ? H2O的混合液； (3) 收集含有地龙蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的地龙蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm ; (7) 纯化后的地龙蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~501：、时间18~2611干燥制 备成冻干蛋白粉。 实施例2: (1) 将1000 g地龙蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，地龙蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的地龙蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种地龙蛆虫蛋白质的制备方法，其特征在于所述制备方法步骤如下：（1）将1000g地龙蛆虫在常温膨化装置中常温条件下膨化粉碎；（2）膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置中，加入由1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3·H2O组成或由1~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组成的膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出地龙蛆虫蛋白质粗品；（3）收集含有地龙蛆虫蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质；（4）用超滤机超滤处理，收集地龙蛆虫蛋白质超滤溶液；（5）超滤液溶解在乙腈中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分；（6）将洗脱成分溶解在由正丁醇‑乙酸乙酯‑水按体积比1.25:3.75:5组成或由聚乙二醇‑葡聚糖T500按重量比4.5:7组成的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱分离纯化；（7）纯化后的地龙蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐华民，赵荣华，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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