本发明专利技术提供了杂交瘤细胞株4E10、其分泌产生的抗邻苯二甲酸二丁酯DBP单克隆抗体及其应用。该杂交瘤细胞株4E10可以用于制备高效价邻苯二甲酸二丁酯DBP抗体，鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达3.12×106；该抗邻苯二甲酸二丁酯DBP单克隆抗体灵敏度高，对邻苯二甲酸二丁酯DBP的50％抑制浓度即IC50为0.22mg/mL，其用于测定邻苯二甲酸二丁酯DBP含量，实际应用价值大。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】杂交瘤细胞DBP-4E10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体
本专利技术涉及杂交瘤细胞株DBP-4E10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体。
技术介绍
邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs)是一类环境激素类物质，具有雌激素活性，干扰生物体内分泌系统正常功能、导致突变、畸变和癌细胞增殖。2005年，欧盟将邻苯二甲酸二辛酯(DEHP)，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)及邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)评定为“第二类生殖毒性”。其中，DBP被认为是毒性最高的酞酸酯类化合物。PAEs化合物是塑料工业的主要增塑剂和软化剂，广泛应用于食品包装材料、容器、医疗用品及塑料等的制造。由于其广泛应用以及从各种制品中的释放，酞酸酯类化合物已经几乎渗透到我们生活的每一个角落。研宄表明，我国居民DBP每日摄入量为12.2mg/kg，超过世界卫生组织建议的10mg/kg.d的每日最大容许摄入量标准。食品被认为是人类暴露于酞酸酯类化合物的主要途径。食品中酞酸酯类化合物的污染主要来自于食品的塑料包装以及生产过程。这是因为酞酸酯是一种脂溶性化合物，它很容易进入食品的脂肪、油脂中，并在其中富集。DBP现有的检测方法GC、MS、HPLC测定DBP灵敏度高、精确度好，而且能分别测定结构相似的多种化合物及其异构体，是目前最理想的检测方法。但是这类分析方法体系将待测污染物从样品中分离提取并去除杂质干扰的前处理过程十分复杂，操作费时，分析成本昂贵。所以开发操作简单、快速、经济且灵敏度高的检测方法具有重要的实际意义。免疫分析方法将免疫反应的高特异性和现代测试手段高灵敏性相结合，具有快速、经济、样品所需量少、前处理简单等优点，成为现代生物化学、医学、化学分析和环境监测等领域的研宄热点。免疫分析是利用抗原抗体的特异性的结合反应和抗原、抗体上的标记物的放大作用来对超微量待测物进行定性、定量检测，所以要研宄建立针对邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的任何一种免疫学检测技术，都必须先获得抗邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的抗体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株DBP-4E10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯DBP的单克隆抗体 本专利技术提供了杂交瘤细株DBP-4E10，该细胞株已于2014年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是，中国，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研宄所，保藏编号为CGMCC N0.10202。分类命名为S/P20杂交瘤细胞。抗邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体由保藏编号为CGMCC N0.10202的杂交瘤细胞株DBP-4E10分泌产生。该DBP单克隆抗体可以识别邻苯二甲酸二丁酯，对邻苯二甲酸二丁酯的50%抑制浓度IC50为0.22 mg/Lo抗邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体在邻苯二甲酸二丁酯测定中的应用。本专利技术提供的杂交瘤细胞株DBP-4E10单克隆抗体是采用三步法筛选获得的，其具体步骤是:以4-硝基邻苯二甲酸酐在H2SO4作用下和正丁醇反应生成4-硝基邻苯二甲酸二丁酯，然后将硝基还原成氨基，在最后在盐酸和亚硝酸钠的存在下发生重氮化作用然后和BSA偶联生成DBP-BSA。用其免疫BLAB/c小鼠4次，最后一次加强免疫用2倍与前一次免疫剂量的DBP-BSA，免疫3天后进行细胞融合。采用ELISA分两步法进行筛选融合细胞:第一步采用间接ELISA法筛选出仅能抗邻苯二甲酸二丁酯而不抗载体蛋白BSA的阳性克隆；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行检测，采用DBP作为竞争源，选择吸光度值低、灵敏度较高的阳性克隆进行有限稀释法继续克隆，克隆10天后采用同样的两步筛选法进行抗体检测，如此重复2次，最终筛选获得的杂交瘤细胞DBP-4E10。本专利技术提供的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的制备方法，步骤如下:将获得的杂交瘤细胞株DBP-4E10注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗邻苯二甲酸二丁酯的单克隆抗体。上述纯化方法的具体操作为:腹水于4°C，3000r/min离心5min以上，吸取上清，将上清与2倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33yL，室温混合30min，4°C静置2h以上，使其充分沉淀。然后4°C，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用砂芯漏斗过滤后，加入1/10滤液体积的0.1mol/L ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，4°C预冷I小时，缓慢加入0.277g/mL硫酸铵至硫酸铵终浓度为45%，4°C静置2h以上，然后40C 12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液加入等体积甘油，置-20°C冰箱中备用； 醋酸盐缓冲液:0.29g醋酸钠加入0.141mL醋酸，纯水定容至10mL ； 0.1mol/L磷酸盐缓冲液:0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL。0.01mol/L磷酸盐缓冲液:用纯水将0.1 mol/L磷酸盐缓冲液稀释10倍。本专利技术的有益效果在于: I本专利技术提供的杂交瘤细胞DBP-4E10可以用于制备高效价的抗邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体，将邻苯二甲酸二丁酯小鼠腹水抗体酶联免疫吸附方法测定的效价达到3.12X 106，即腹水稀释至3.12 X 16时溶液测定结果仍为阳性。2本专利技术提供的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对邻苯二甲酸二丁酯的半抑制浓度IC50为0.22 mg/L，与邻苯二甲酸二乙丁酯的交叉反应率36.9%，与邻苯二甲酸丁苄酯的交叉反应率10.7%，与其他结构类似物的交叉反应率均小于1%。3本专利技术提供的抗邻苯二甲酸二丁酯的单克隆抗体可用于测定邻苯二甲酸二丁酯的含量。【附图说明】图1 DBP-4E10单克隆抗体对DBP的标准曲线。【具体实施方式】实施例1:杂交瘤细胞株DBP-4E10的筛选 1.抗原的合成及动物的免疫 4-硝基邻苯二甲酸酐与正丁醇生条件下发生酯化反应，得到4-硝基邻苯二甲酸二丁酯，再在酸性条件下与锌粉发生还原反应，得到半抗原衍生物4-氨基邻苯二甲酸二丁酯酯，有苯氨基的邻苯二甲酸酯半抗原衍生物在低温下与NaN02和浓HCl发生重氮化反应，生成相应的重氮盐；重氮盐与载体蛋白发生偶联反应，得到相应的人工抗原。4-硝基邻苯二甲酸二丁酯的合成 将2.5克4-硝基邻苯二甲酸溶于50mL正丁醇中，向其中缓慢滴入ImL浓H2S04作催化剂，在120°C下反应并不断搅拌。反应结束后，用10%NaC03洗涤三次，每次10mL。80°C旋转蒸发除去正丁醇和水。得油状物质4-硝基邻苯二甲酸二丁酯，称重。4-氨基邻苯二甲酸二丁酯酯的合成 称取0.1523克4-硝基邻苯二甲酸二丁酯；加入28mL苯和0.28g锌粉，然后分三次加入8.2mL浓HC1，搅拌反应18min后再加入0.28克锌粉，室温搅拌反应12h。反应结束后，分液；然后用34mLH20清洗苯层，分别用5g无本文档来自技高网...
【技术保护点】
杂交瘤细胞株DBP‑4E10，其特征在于：已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO. 10202。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：时国庆，孙清，邓乾民，栗时锋，高永杰，曹雨，
申请(专利权)人：北京科技大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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