一种杂交瘤细胞株、及其分泌单克隆抗体和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种杂交瘤细胞株及其所产生的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体。本发明专利技术提供的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体，对猪流行性腹泻病毒具有预防和/或治疗作用，解决了现有疫苗、母源抗体不足时所引发的仔猪流行性腹泻病毒感染，并且弥补现有疫苗单一的预防作用；还可用于开发猪流行性腹泻病毒的诊断试剂产品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种杂交瘤细胞株、其所分泌的单克隆抗体、使用分泌的单克隆抗体制备的药物组合物、试剂盒及应用，属于生物医药领域。
技术介绍
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的急性、接触性、高度传染性消化道疾病，主要症状为呕吐、水样腹泻和脱水，感染7日龄以内仔猪死亡率高达80％-100％。对我国养猪业造成巨大的损失。自2010年以来，我国秋冬季节大面积爆发腹泻疾病，与此同时，韩国、日本、台湾、美国等地也大范围爆发此病。分子生物学研究表明，猪流行性腹泻病毒发生了变异，已有的疫苗株对流行毒株的感染起不到很好的保护作用。目前，国内外已有的商品化疫苗均为经典的疫苗株，对控制本病虽有一定的效果，但仍不能提供给仔猪很好的被动保护。同时，仔猪获得母源抗体的水平不均一，易引起部分仔猪再次发病并使病原迅速传播。虽已有用于预防或治疗猪流行性腹泻病毒的卵黄抗体，但卵黄抗体是高蛋白质，不仅成本较高，在生产过程中还易发生细菌感染而不易规模化生产(张家峥，施萍，牛桂玲.使用高免卵黄抗体液利弊及前景.中国家禽，2003,25(23):45)。基于此，亟需一种新的途径解决现有疫苗、母源抗体不足时所引发的猪流行性腹泻病毒感染，以及现有疫苗单一的预防作用。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株、其所产生的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体及应用，该单克隆抗体可以预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒所引发的感染，还可用于检测猪流行性腹泻病毒。本专利技术的第一方面在于提供小鼠骨髓杂交瘤细胞8A3A10株，所述杂交瘤细胞8A3A10株保藏号为CCTCC No.C2014197，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2014年11月3日。本专利技术的小鼠骨髓杂交瘤细胞8A3A10株由猪流行性腹泻病毒HN1301株抗原免疫小鼠后，取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选制得。其所产生的单克隆抗体的中和抗体效价大于1:512，具有良好的中和活性；单克隆抗体的相对亲和力常数为1:5120，与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高。本专利技术的第二方面在于提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述杂交瘤细胞8A3A10株分泌产生。所述单克隆抗体能有效抵抗猪流行性腹泻病毒，所述单克隆抗体是由所述杂交瘤细胞8A3A10株分泌产生。所述单克隆抗体的中和抗体效价大于1:512，也就是说，所述单克隆抗体具有良好的中和活性，可抑制猪流行性腹泻病毒重复感染靶细胞；所述单克隆抗体的相对亲和力常数为1:5120，也就是说，其与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高，优于现有技术中的抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的结合强度。术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。术语“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。术语“抗体”可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本专利技术的“单克隆抗体”可用杂交瘤方法制得，因为编码本专利技术鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本专利技术抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本专利技术的单克隆抗体。术语“中和抗体”在本文以最广义使用，指的是抑制猪流行性腹泻病毒重复感染靶细胞的任何抗体，而不管实现中和的机制。因而，举例来说，可通过抑制病毒附着或粘附到细胞表面来实现中和，例如通过设计抗体，所述抗体直接结合到，或者接近于，负责病毒附着或粘附的位点，还可以通过定向到病毒体(Virion)表面的抗体来实现中和，其导致病毒体的聚集，可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和细胞膜融合，通过抑制胞吞作用(endocytosis)抑制来自受感染的子代病毒等，进一步发生中和。本专利技术的中和抗体不受限于实现中和的机制。本专利技术的第三方面在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包括有效量的所述杂交瘤细胞8A3A10株分泌产生的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或上述的组合，以及药学上可接受的载体。术语“单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体”，又可称为“单克隆抗体之保守性变异体或活性片段”，所述保守性变异体或活性片段的氨基酸序列中与本专利技术所述单克隆抗体之氨基酸序列相比存在一个或多个保守性氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与猪流行性腹泻病毒特异性结合。术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽。但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
小鼠骨髓杂交瘤细胞8A3A10株，所述杂交瘤细胞8A3A10株保藏号为CCTCC No：C2014197，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2014年11月3日。

【技术特征摘要】
1.小鼠骨髓杂交瘤细胞8A3A10株，所述杂交瘤细胞8A3A10株保
藏号为CCTCC No：C2014197，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏
地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2014年11月3日。
2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1
所述的杂交瘤细胞8A3A10株分泌产生。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括有效量的
权利要求2所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或上述的组
合，以及药学上可接受的载体。
4.一种制备权利要求3所述的药物组合物的方法，所述方法包括：
(1)使用权利要求1所述的杂交瘤细胞8A3A10株分泌表达单克隆
抗体；以及
(2)将所述步骤(1)中表达的单克隆抗体加入药学上可接受的载
体。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有效量的权利要求2
所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或上述的组合，所述的
单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体或上述的组合用于和猪流行
性腹泻...

【专利技术属性】
技术研发人员：田克恭，王延辉，张云静，
申请(专利权)人：洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41