本发明专利技术涉及可以长期维持且无饲养细胞的未分化的精原干细胞的产生和培养。所得的无饲养细胞的群体可以用于许多方案中的任一种，包括子代公牛的产生。本发明专利技术包括成功富集牛精原干细胞所需的新方法、新细胞系和用于成功富集牛精原干细胞的其他组分，以及所得的干细胞组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】 相关申请的夺叉引用 本申请根据35U. S. C. § 119要求2012年2月14日提交的临时申请序列号 61/598, 437的优先权，其整体援引加入本文。 咨助信息 本专利技术用美国农业部授予的合同号117232-001的政府支助进行。政府具有本发 明中的某些权利。
技术介绍
干细胞是未分化的细胞，具有两个标志性特征：自我更新以及分化为一种或多种 不同细胞谱系的能力。自我更新的过程包括干细胞的自我复制以允许增殖和扩增，其中所 述干细胞保持未分化的状态。祖细胞也是具有分化为一种或多种细胞谱系的能力的未分化 的细胞，但是具有有限的自我更新或不能自我更新。当在培养中维持时，未分化的细胞如干 细胞或祖细胞可以进行自发分化，从而丧失期望的未分化的细胞表型。因此，需要最小化自 发分化以保持未分化的干细胞或祖细胞状态的方法。 使未分化的细胞保持未分化的状态对于它们例如在工业和医药中的用途非常重 要，因为这些细胞的主要科学和治疗实用性在于它们扩增为同质群体的能力，所述同质群 体可以根据需要进一步增殖或分化为成熟细胞，例如用于科学研究或者修复患者的细胞或 组织的损伤。一旦它们在细胞培养中已自发分化，细胞较少增殖，并且较不能够根据需要分 化为不同类型的细胞。因此未分化的干细胞的同质培养是研究科学家和工业高度追求但未 实现的目标。 目前培养未分化的细胞（例如，各种类型的干细胞）的方法试图通过每天或比每 天更不频繁地将成纤维细胞生长因子2 (FGF2)递送至细胞培养物来最小化这样的自发分 化，这称作饲养。已显示FGF2通过抑制干细胞的分化来促进干细胞的自我更新；但是 这种抑制是不完全的，并且干细胞培养物倾向于逐步分化，从而减少干细胞培养物的实用 性。此外，干细胞如胚胎或精原干细胞通常需要在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)饲养细胞上 生长。这是个期望去除的繁琐步骤，并且导致污染了饲养细胞的细胞干细胞群体，其不可以 用于各种受精方案和配子的产生。 在体外有条件地诱导干细胞系发育经过精子发生过程以产生配子的能力会为生 物医学研究和动物育种（特别是如果可以对各种物种建立这类方案）提供长期追求的技 术。到目前为止，仅在大鼠和小鼠中最为成功，而较大的哺乳动物如牛，则没有这样的进展。 位于解离的小鼠和大鼠睾丸细胞级分内的干细胞保持它们在受体小鼠的睾 丸中再生精子发生的能力的发现对于建立这类培养系统非常重要。参见Brinster et al.,ProcNatlAcadSci USA 1994;91:11303-11307 ；Brinster et al. , ProcNatlAcadSci USA 1994 ；91 : 1 1298-1 1302 ；Clothier et al. ,Nature 1996;381:418-421； Kanatsu-Shinohara et al. , Biol Reprod 2003 ;69:612-616 ;和 Nagano et al·，Tissue Cell 1998;30:389-397。分离并实验操作这些干细胞的能力为精子发育、辅助生殖、 细胞疗法和遗传学的研究打开了新的大门。参见Nagano et al.，BiolR印rod 1999; 60:1429-1436 ；Mahanoy et al., Endocrinology 2000 ； 141:1273-1276 ；Mahato et al.，Mol Cell Endocrinol 2001; 178:57-63 ;0gawa et al·，Nat Med 2000;6:29-34; Shinohara et al. , Proc Natl Acad Sci USA 2006 ； 103:13624-13628 ；Zhang et al. , J Cell Physiol 2007 ；211:149-158 ；Kazuki et al. , Gene Ther 2008;15:617-624； Kanatsu-Shinohara et al. , CelI 2004 ; 119:1001-1012 ;Kanatsu_Shinohara et al·，Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:8018-8023 ;和 Nagano et al·，Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:13090-13095。鉴于这种潜能，已建立分离、增殖和遗传修饰培养中的全 功能大鼠和小鼠精原干细胞的方案。参见Ryu et al.，Dev Biol 2004;274:158-170 ;Hamra et al. , Dev Biol2004 ；269:393-410 ；Hamra et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2002； 99:14931-14936 ；Hamra et al.,Methods Mol Biol2008 ；450:163-179 ；Hamra et al. , Proc Natl Acad Sci USA 2005 ； 102:17430-17435 ；Ryu et al. , Proc Natl Acad Sci USA2005 ； 102:14302-14307 ;0rwig et al·, Biol Reprod 2002;67:874-879;和 Kanatsu-Shinohara et al.，Biol R印rod 2008。选择小鼠和大鼠作为这些研究的物种，这是由于它们作为人 健康和疾病研究的实验室动物模型的普及，并且由于缺少利用来自培养的克隆扩增的干 细胞遗传修饰大鼠生殖系的方案。参见Hamra et al.，Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:14931-14936。考虑到实验室大鼠作为研究模型的许多潜在应用，在这个研究中寻求成 本效益和易于制备的培养基用于体外原代大鼠精原干细胞的衍生和连续增殖。 尽管有这些进展，甚至在大鼠物种中，方法是复杂的且大部分不成功。例如，用于 体外啮齿动物精原干细胞的长期增殖的培养基相对复杂、昂贵、制备费事，加上在与成纤维 细胞的饲养层组合应用时最有效。 可以看到需要培养精原干细胞的方法，特别是较大的哺乳动物如牛。
技术实现思路
本专利技术包含用于培养精原干细胞的组合物和方法。根据本专利技术， 申请人:已开发一 种无饲养细胞的培养系统，其允许培养的精原干细胞保持未分化的状态并在培养中长期保 持存活。本专利技术的另一方面包括从睾丸组织分离未分化的精原细胞的方法，鉴定在体外支 持未分化的精原细胞存活的特异性无血清的培养基，用于包被未分化的精原细胞粘附的 塑料培养孔的基材，并且最终 申请人:已鉴定用于补充饲养细胞条件培养基的特异性生长因 子，其促进牛未分化的精原细胞的维持和生长。虽然所述方法和实例公开了牛细胞，但是本 专利技术并不限于此，其可应用于所有家畜物种，包括猪。 根据本专利技术， 申请人:已鉴定了具体的专有细胞系，包括牛胚胎成纤维细胞细胞系 以及分离自牛睾丸的牛体细胞系。这些具体细胞系在培养任何SSC之前用作饲养支持细胞 以处理培养基。预培养技术允许无饲养本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从包含至少一个精原干细胞(SSC)的睾丸来源的细胞群体富集精原干细胞的方法，所述方法包括：a)提供已用饲养细胞系预处理的培养基；b)使所述睾丸来源的细胞群体与所述预处理的培养基在适合SSC细胞维持和富集的条件下接触。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.02.14 US 61/598,4371. 一种从包含至少一个精原干细胞（SSC)的睾丸来源的细胞群体富集精原干细胞的 方法，所述方法包括： a) 提供已用饲养细胞系预处理的培养基； b) 使所述睾丸来源的细胞群体与所述预处理的培养基在适合SSC细胞维持和富集的 条件下接触。2. 权利要求1的方法，其中所述预处理的培养基是通过使所述培养基与来自牛胚胎成 纤维细胞和/或分离自牛睾丸的牛体细胞的细胞株的细胞或其部分接触来产生的。3. 权利要求2的方法，其中所述细胞株选自细胞系BEF1和细胞系BSC1。4. 权利要求2的方法，其中预处理包括以下步骤：a)使培养基与选自牛胚胎成纤维细 胞和/或牛睾丸体细胞的饲养细胞接触；b)允许所述细胞在所述培养基上增殖；且此后c) 去除所述饲养细胞。5. 权利要求4的方法，其中所述细胞饲养细胞源自细胞系BEF1和/或BSC1。6. 权利要求1的方法，其中所述细胞为牛细胞。7. 用于预处理培养基以培养牛精原干细胞的牛胚胎成纤维细胞细胞系BEF1，保藏为 ATCC登录号_。8. 用于预处理培养基以培养牛精原干细胞的牛体细胞系BSC1，保藏为ATCC登录号 _〇9. 一种从牛睾丸组织分离精原干细胞的方法，所述方法包括： a. 从个体获得睾丸组织 b. 用胶原酶温育所述组织以分离精原细胞和支持细胞 c. 从其他细胞类型分离小管 d. 用胰蛋白酶消化小管以获得精原细胞和支持细胞的悬浮液，以及 e. 从所述悬浮液分离精原细胞和支持细胞。10. 权利要求9的方法，其中所述从其他细胞类型分离小管是通过重力沉降。11. 权利要求9的方法，其中所述从所述悬浮液分离精原细胞和支持细胞是通过离心 并在支持细胞优先结合的培养皿上温育。12. 权利要求1的方法，其中所述预处理的培养基为DMEM/F12培养基。13. 权利要求1的方法，其中所述培养基补充了血清替代补充物。14. 权利要求12的方法，其中所述血清替代补充物为StemPro。15. 权利要求1的方法，其中所述培养维持在塑料培养孔中。16. 权利要求14的方法，其中用Matrigel包被所述塑料培养孔，从而精原细胞会粘附 并在长期培养中维持。17. 权利要求1的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·奥特利，M·J·奥特利，
申请(专利权)人：华盛顿州立大学，
类型：发明
国别省市：美国;US
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