用于在产油酵母中表达基因的通用基因表达系统技术方案

本发明专利技术公开了一种用于在包括解脂耶氏酵母和圆红冬孢酵母在内的产油酵母中表达多基因产物的新系统和方法。更具体地，本公开提供了在解脂耶氏酵母中有功能的新型启动子，其可用于生产范围广泛的生物产品。用于生产范围广泛的生物产品。用于生产范围广泛的生物产品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】toruloides(anamorph,Rhodotorula glutinis)是另一种重要的产油酵母，并且由于其高脂肪产量、对木质纤维素生物质水解产物中存在的抑制性化合物的耐受性以及其利用C5糖的能力，其引起了广泛关注。除了微生物脂质生产外，它还经过基因改造以生产脂肪醇和蓝色色素靛蓝。包括PPGI、PPGK、PFBA、PTPI和PGPD在内的多种组成型启动子已经从圆红冬孢酵母基因组中表征。异源途径的多框架工程可以提高成功生产天然产物的机会，并且宿主独立表达系统将进一步能够在不同框架生物体中快速构建。然而，还没有关于在解脂耶氏酵母和圆红冬孢酵母中均有功能的启动子的报道。
[0010]随着合成生物学的发展，已经实施了精细的方案和复杂的工程来重建人工生物系统，包括具有17个亚基的大蛋白复合物的表达、重新设计的细菌微区室细胞器(例如CO2固定羧基体)和模块化信号转导系统(例如细胞中的G蛋白偶联受体(GPCR)信号)。特别是，降解和生物合成途径都涉及多个基因来完成生化功能。为了让酿酒酵母产生植物来源的生物碱胡豆苷，在酵母菌株中表达21个外源基因。为了发现和设计天然产物生物合成，通过在异源宿主中的特征调控部分下表达目的基因来重构生物合成基因簇(BGC)。在细菌中，多个基因可以组织成一个合成的操纵子，并且其表达可以很容易地通过核糖体结合位点(RBS)进行调整。相反，为了构建真核生物中的通路，将BGS中的每个基因都克隆到上游(启动子)和下游(转录终止子)区域之间，然后将表达盒引入宿主。因此，不断需要表达多个基因的新工具来更有效地设计真核细胞工厂。
[0011]为了能够在真核生物中方便地表达多个基因，小核糖核酸病毒的2A肽已被用于模式生物酿酒酵母、甲基营养型酵母毕赤酵母和真菌构巢曲霉中。使用已知的自剪接2A肽，多顺反子基因可以翻译成肽并在翻译过程中“切割”。来自小核糖核酸病毒的2A肽已成功用于在多种真核细胞(包括真菌、植物、昆虫和哺乳动物)中表达异源基因。然而，来自包括马鼻炎A病毒(E2A)、人口蹄疫病毒(F2A)、猪捷申病毒
‑
1(P2A)和明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒(T2A)在内的不同病毒的由约20个氨基酸组成的2A肽表现出不同的切割效率，并且2A肽的功能未在产油酵母解脂耶氏酵母中进行测试。此外，使用2A肽的主要缺点之一是将部分消化的2A肽序列添加到蛋白质的C末端，从而干扰酶活性。据观察，在多顺反子构建体中与2A肽相连的基因的顺序对通路生产力有很大影响。最后，构建由用2A序列分隔的所有单个基因组成的多顺反子片段仍然费时费力。
[0012]在建立用于重要的工业相关菌株解脂耶氏酵母和圆红冬孢酵母的遗传操作的分子工具箱方面已经取得了实质性进展，然而，迄今已知的已开发表达系统具有许多缺点和局限性。
[0013](a)解脂耶氏酵母中表征的诱导型启动子主要对疏水底物例如补充的油酸有响应，但被在培养基中的葡萄糖所抑制。这些启动子的应用受到限制，因为它需要碳源的剧烈变化。
[0014](b)阻抑型启动子已被用作下调基因表达的重要工具。然而，在解脂耶氏酵母中没有报道这样的阻抑型启动子。
[0015](c)要构建通用的基因表达系统，需要在不同菌株中发挥作用的启动子。尽管在工业相关生物解脂耶氏酵母和圆红冬孢酵母中已经表征了广泛的启动子，但没有发现在解脂耶氏酵母和圆红冬孢酵母二者中具有功能的报告基因。
[0016](d)自剪接2A肽已被用作构建多顺反子转录本以在真核生物中表达多个基因的强
大工具，但尚未探索其在解脂耶氏酵母中的应用。
[0017](e)部分消化的2A肽序列将附加到蛋白质的C末端，因此可靠的表达系统的开发必须消除此附加短肽序列的干扰。
[0018](f)使用传统的克隆方法开发由2A肽序列介导的多个基因组成的多顺反子构建体是一项劳动密集型过程。一种无缝组装由2A序列组成的基因片段的新方法可以促进大型多顺反子结构的构建。
[0019]本申请提供了方法和组合物，包括用于在产油酵母解脂耶氏酵母和圆红冬孢酵母中表达多个基因的表达载体。

技术实现思路

[0020]本公开涉及用于制备编码多个基因以调节包括解脂耶氏酵母和圆红冬孢酵母在内的产油酵母的酶促途径的核酸构建体的新系统和方法。这些含油酵母已成为通过合成生物学生产广泛生物产品的新型微生物基础。然而，目前可用于操作产油酵母的工具并不是最佳的。
[0021]根据本公开的一个实施方案，从解脂耶氏酵母中分离了六种具有双向功能的铜诱导型启动子和五种阻抑型启动子并用于表达载体中。本文公开的两种阻抑型启动子(SEQ ID NO:10
‑
11)在非阻抑条件下显示出与强组成型启动子相比相对较高的活性，但可以通过在解脂耶氏酵母中补充低含量的Cu
2+
来几乎完全抑制。
[0022]根据一个实施方案，本文公开的Cu
2+
诱导型启动子，包括SEQ ID NOs:1
‑
6的启动子序列，可以被工程化以通过可操作地连接串联的上游激活序列(UAS)来提高每个相应启动子的强度。这种工程化的启动子被成功地用于构建一种比天然Cu
2+
诱导型启动子和组成型启动子二者更高效的途径来生产新型高价值生物产品蜡酯。已通过修饰天然启动子圆红冬孢酵母(修饰的RtGPD；SEQ ID NO:21)开发了在解脂耶氏酵母和圆红冬孢酵母二者中有功能的合成启动子。通过使用来自小核糖核酸病毒的“自切割”2A肽序列，本文公开了一种精心制作但易于组装的载体系统，以在单个启动子的控制下方便地表达多个基因。总而言之，这些共同努力促进了一种新型遗传操作系统的开发，该系统可以方便地在解脂耶氏酵母和圆红冬孢酵母二者中表达多个基因，而无需依赖宿主的优化。它是适用于在选定的微生物宿主中进行多基因表达的强大工具。
[0023]根据一个实施方案，提供了在解脂耶氏酵母中有功能的新型诱导型和阻抑型启动子。这些包括包含选自SEQ ID NO:1
‑
6的序列的Cu2+诱导型启动子，包含选自SEQ ID NO:7
‑
9的序列的氨基酸阻抑型启动子和包含选自SEQ ID NO:10
‑
11的序列的Cu2+阻抑型启动子。
[0024]根据一个实施方案，提供了转录元件，其包含启动子和可操作地连接到所述启动子的多接头，使得当编码序列通过多接头的核酸内切酶限制性位点之一插入多接头位点时，编码序列可操作地连接到启动子并且能够被所述启动子转录。在一个实施方案中，启动子包含选自由SEQ ID NO:1(P
MT
‑1)、SEQ ID NO:2(P
MT
‑2)、SEQ ID NO:3(P
MT
‑3)、SEQ ID NO:4(P
MT
‑4)、SEQ ID NO:5(P
MT
‑5)、SEQ ID NO:6(P
MT
‑6)、SEQ ID NO:7(P
THR1
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种转录元件，其包含：启动子；和多接头，其中所述启动子包含选来自于SEQ ID NO:1(P
MT
‑1)、SEQ ID NO:2(P
MT
‑2)、SEQ ID NO:3(P
MT
‑3)、SEQ ID NO:4(P
MT
‑4)、SEQ ID NO:5(P
MT
‑5)、SEQ ID NO:6(P
MT
‑6)、SEQ ID NO:7(P
THR1
)、SEQ ID NO:8(P
MET3
)、SEQ ID NO:9(P
SER1
)、SEQ ID NO:10(P
CTR1
)和SEQ ID NO:11(P
CTR2
)组成的组的核酸序列，或与选来自于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成的组的核酸序列具有至少95％序列同一性的核酸序列，并且进一步地，其中所述多接头可操作地连接至所述启动子序列。2.根据权利要求1所述的转录元件，其中所述启动子序列包含选来自于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组的序列，任选地其中所述启动子序列包含选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6组成的组的序列，任选地其中所述启动子包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。3.根据权利要求2所述的转录元件，进一步包含可操作地连接到所述启动子序列的1至16个UAS序列，任选地其中所述UAS序列中的每一个是相同的并且包含SEQ ID NO:12的序列。4.权利要求1
‑
3中任一项所述的转录元件，进一步包含位于所述多接头下游的2A多肽编码核酸序列，任选地其中编码的2A肽具有序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:13)或GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:14)。5.根据权利要求4所述的转录元件，其中所述2A多肽编码核酸序列包含与SEQ ID NO:15具有99％序列同一性的序列。6.根据权利要求4或5所述的转录元件，其中所述转录元件包含多个2A多肽编码核酸序列，其中所述多个2A多肽编码核酸序列中的每一个各自由至少一个对所述转录元件独特的限制酶切割位点进行。7.根据权利要求6所述的转录元件，还包含编码TEV肽酶的核苷酸序列。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的转录元件，还包含来自位于所述启动子和所述多接头之间的基因tef的第一内含子。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的转录元件，其形成为质粒。10.根据权利要求2
‑
9中任一项所述的转录元件，其中所述启动子在启动子序列的每一端侧翼具有多接头序列。11.根据权利要求1
‑
10中任一项所述的转录元件，进一步包含选择标记，任选地其中所述选择标记是营养缺陷型标记，任选地其中所述营养缺陷型标记是leu2。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的转录元件，进一步包含抗生素抗性基因作为选择标记。13.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的转录元件，进一步包含解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的复制区。14.根据权利要求1
‑
13中任一项所述的转录元件，进一步包含大肠杆菌(E.coli)的复制区。
15.根据权利要求1
‑
14中任一项所述的转录元件，其中所述启动子可操作地连接至异源编码序列。16.包含权利要求15所述的核酸的解脂耶氏酵母(...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊小超，陈树林，
申请(专利权)人：华盛顿州立大学，
类型：发明
国别省市：