Nrf2在制备治疗tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病的治疗系统中的应用技术方案

本发明专利技术涉及神经系统疾病治疗药物及系统技术领域，具体涉及Nrf2在制备治疗tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病的治疗系统中的应用。通过对tRNA合成酶缺陷突变体的研究，我们发现tRNA合成酶缺陷会引起斑马鱼中脑尺寸减小，出现小脑症和脑萎缩的症状。对上述过程涉及的Perk信号通路进行深入研究发现，nfe2l2b基因以及Nrf2蛋白是调控神经发育过程的关键因子，并且其下游直接作用的靶基因为p53。发明专利技术人进而将nfe2l2基因应用到制备治疗神经系统疾病的治疗系统中以及应用到相关药物筛选中，解决了现有技术中尚无有效治疗tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病的手段的技术问题，具有理想的推广应用价值。的推广应用价值。的推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】
synthetases)，ENU
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突变体即为aars1
ENU
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突变体。该突变体相对于野生型表现出斑马鱼幼鱼活性差(图2)，神经祖细胞(neural progenitor cells，NPCs)凋亡增加(图4)，中脑体积减小(实施例1中3dpf幼鱼中脑体积测量数据)，一些与神经发育相关的基因的表达量降低(图1)。为进一步证实aars1基因的作用，专利技术人利用了CRISPR/Cas9系统对aars1基因进行了敲除，获得了aars1
CRISPR
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突变体。同aars1
ENU
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突变体一样，aars1
CRISPR
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突变体的中脑发生萎缩，且凋亡信号增强(图8)。上述研究说明，aars1基因的缺失会带来tRNA合成酶缺陷引起的小脑症或者脑萎缩等神经系统疾病，疾病模型构建成功。
[0010]在上述疾病模型中，专利技术人研究发现Perk信号通路在以aars1
ENU
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突变体为例的aars1基因突变体中被激活，进而诱导了神经祖细胞的凋亡。接下来，专利技术人在293T细胞中研究发现NRF2蛋白与Perk信号通路介导的细胞凋亡相关，进而将tRNA合成酶缺陷与NRF2蛋白相关联。转录因子NRF2是nfe2l2基因(nuclear factor erythroid
>‑
derived 2
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like 2)编码的蛋白，现有技术报道其功能主要是发挥抗氧化作用等。
[0011]为了进一步研究NRF2蛋白与小脑症或者脑萎缩等tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病的关系，专利技术人继续在斑马鱼中进行研究。在斑马鱼中人源的NRF2蛋白的旁系同源基因包括nfe2l2a基因和nfe2l2b基因，nfe2l2b基因是新发现的旁系同源基因，尚无文献报道。实验结果显示，在aars1
ENU
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突变体中的nfe2l2b基因的表达量显著提升(图14)，提示nfe2l2b基因的表达水平可能与aars1
ENU
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突变体中的细胞凋亡相关。利用了CRISPR/Cas9系统对nfe2l2b基因进行了敲除，获得nfe2l2b
CRISPR
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突变体。nfe2l2b
CRISPR
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突变体可以存活至成年，并且在外观上和其他两种没有显著区别(图16)，这说明对nfe2l2b基因的活性蛋白量减少(甚至缺失)之后，对生物体产生的副作用不显著，为后续使用nfe2l2b基因抑制剂或者其他抑制该基因表达的方法提供了参考。在细胞凋亡方面，敲除nfe2l2b基因后，细胞凋亡信号降低(图16)。特别是在aars1
ENU
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nfe2l2b
CRISPR
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双突变体中，其细胞凋亡信号(TUNEL
+
)显著低于aars1
ENU
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突变体。在中脑尺寸方面(图17)，nfe2l2b基因敲除后，可以增加中脑的尺寸，显示出nfe2l2b基因对于改善小脑症或者脑萎缩等tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病的潜能。
[0012]除了上述研究之外，专利技术人还对nfe2l2b基因编码蛋白的下游作用对象进行了研究，发现p53基因为nfe2l2b基因编码蛋白的直接作用靶点，该蛋白可以和p53基因的启动子区域发生结合，进而调控p53基因的表达(图20)。在nfe2l2b
CRISPR
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突变体中，p53基因的表达量降低，而在注射外源nfe2l2b mRNA的斑马鱼中p53基因的表达量上升(图21)。故，nfe2l2b基因编码蛋白(即NRF2蛋白)或者nfe2l2b mRNA可以作为p53基因的调控物质来控制p53基因参与的凋亡过程。除此之外，还可利用Nrf2蛋白或者nfe2l2b mRNA对于p53基因的转录激活作用，来进行p53基因的表达调控，进而研究p53基因对神经细胞凋亡等途径的研究。
[0013]除了丙氨酰tRNA合成酶缺陷之外，专利技术人还通过ENU诱变的方法获得了苏氨酰tRNA合成酶缺陷(threonyl
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tRNA synthetases)动物模型，并证实了nfe2l2b基因和苏氨酰tRNA合成酶缺陷引起的疾病相关。因此，Nrf2可以应用在制备治疗氨酰基tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病的治疗系统中。
[0014]进一步，所述tRNA合成酶缺陷包括氨酰基tRNA合成酶缺陷。氨酰基tRNA合成酶缺陷会引起小脑症或者脑萎缩的症状。
[0015]进一步，所述氨酰基tRNA合成酶缺陷包括丙氨酰tRNA合成酶缺陷以及苏氨酰tRNA合成酶缺陷。本方案具体在丙氨酰tRNA合成酶缺陷模型中以及苏氨酰tRNA合成酶缺陷模型中，进行了相关实验，证明了Nrf2基因在tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病中起到了重要作用。
[0016]进一步，所述治疗系统用于降低Nrf2蛋白的活性，或者降低Nrf2蛋白的表达水平，或者降低nfe2l2基因的转录水平，或者敲除nfe2l2基因。采用上述方法均可以使得Perk
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Nrf2
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P53信号通路受到阻碍，进而避免了神经祖细胞的凋亡，缓解tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病。
[0017]进一步，所述治疗系统为用于敲除nfe2l2基因的CRISPR/Cas9系统。本技术方案利用CRISPR/Cas9系统，进行nfe2l2基因的敲除操作，该系统成熟并且有较高的效率和操作方便程度。下调体内nfe2l2b基因表达水平以及其蛋白表达水平或者抑制其蛋白活性，可实现对神经祖细胞的凋亡记忆神经发生的调控，进而缓解由于tRNA合成酶缺陷导致的神经功能系统疾病，特别是小脑症以及脑萎缩等。本实施例通过CRISPR/Cas9的手段将nfe2l2b基因敲除，实现了对神经元的凋亡的抑制，进而实现了对疾病的治疗目的。通过CRISPR/Cas9系统进行基因敲除，是为了研究nfe2l2b基因在tRNA合成酶缺陷导致的神经功能系统疾病中起到的作用，是一种较为极端的做法(基因完全失活)。通过上述方法验证了nfe2l2b基因是一种疾病治疗靶点，进而应用到tRNA合成酶缺陷导致的神经功能系统疾病的药物的制备当中。在实际操作中，我们可以采用任意的可以下调体内nfe2l2b基因表达水平(例如RNA干扰技术等)以及其蛋白表达水平或者抑制其蛋白活性(例如使用nfe2l2b蛋白抑制剂等)的手段。
[0018]进一步，所述CRISPR/Cas9系统的gRNA的靶序列为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.nfe2l2基因在制备治疗tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病的治疗系统中的应用。2.根据权利要求1所述的nfe2l2基因在制备治疗tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病的治疗系统中的应用，其特征在于，所述tRNA合成酶缺陷包括氨酰基tRNA合成酶缺陷。3.根据权利要求2所述的nfe2l2基因在制备治疗tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病的治疗系统中的应用，其特征在于，所述氨酰基tRNA合成酶缺陷包括丙氨酰tRNA合成酶缺陷以及苏氨酰tRNA合成酶缺陷。4.根据权利要求3所述的nfe2l2基因在制备治疗tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病的治疗系统中的应用，其特征在于，所述治疗系统用于降低Nrf2蛋白的活性，或者降低Nrf2蛋白的表达水平，或者降低nfe2l2基因的转录水平，或者敲除nfe2l2基因。5.根据权利要求4所述的nfe2l2基因在制备治疗tRNA合成酶缺陷引起的神经系统疾病的治疗系统中的应用，其特征在于，所述治疗系统为用于敲除nfe2l2...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书一一页序列表五页附图一三页，
申请(专利权)人：润康生物医药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：