制备忍冬纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含该提取物的组合物技术

本发明专利技术涉及一种用于制备忍冬的纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含有该提取物的组合物。忍冬的纯化提取物显示出在重度败血症CLP模型试验中有效的抗败血症活性，对MODS的效果，和对各种促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ、HMGB-1等的抑制效果，同时，在与可商业获得的抗菌剂、例如广谱抗生素组合的情况下，它还出乎本领域技术人员意料地显示出对败血症和败血性休克的治疗的协同效应，因此，它可以作为药物和健康功能食品用于治疗和预防败血症和败血性休克。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备忍冬纯化提取物的方法以及用于预防和治疗败血症和 败血性休克的含该提取物的组合物
本专利技术涉及一种制备忍冬（LoniceraJaponicaTHUNBERG)的纯化提取物的方法 以及用于预防和治疗败血症和败血性休克的含有该提取物的组合物。
技术介绍
重度败血症是致命的疾病，其具有由伴随有器官功能衰竭和灌注不足的败血症病 情引起的高死亡率，所述灌注不足导致系统需氧和供氧之间的不平衡，这迅速进展成败血 性休克和多器官功能障碍综合征（MODS)。该疾病的典型症候群为高热、低体温症、正性变 时（positivechronotrophy)、增加的心输出量、降低的体循环抵抗力、呼吸性碱中毒、不正 常增加或减少量的WBC等，这引起导致致命死亡的迅速的器官功能障碍。已经报道患有重 度败血症和败血性休克的患者的死亡率在美国为29%，在欧洲为27%，这是重症监护病房 的患者中的主要死亡原因（Jean-LouisVincent，EdwardAbraham，TheLastlOOyearsof S印sis，AmJRespirCritCare]^(1，2006，173，第256-263页）。在美国，每年多于750000 名患者患有败血性综合征，其中每年多于210000患者死于该疾病。而且，在欧洲在重症监 护病房住院的约37 %的患者患有重度败血症，15 %的患者患有败血性休克，在韩国由重度 败血症导致的死亡率为65%。 败血症可能会因非传染性来源，例如除传染性来源如细菌、病毒、真菌等之外 的创伤而恶化，并加重成败血性休克或MODS(Deitch，E.A.Multipleorganfailure. Pathophysiologyandpotentialfuturetherapy,Ann.Surg. ,1992,216 (2),第 117-134 页）。败血症发病机理的最明显的特征为在初始阶段体内炎症系统的过度活化，即识别外 来污染物如细菌内毒素并被该外来污染物激活的促炎性细胞因子的过度分泌，这被称为 细胞因子风暴并从败血症发病起维持10至12小时。在细胞因子中，在血液中在初始 阶段最开始所检测到的细胞因子TNG-a不仅刺激其他细胞因子如IL-5、IL-8的分泌，也 促进中性粒细胞和血管内皮细胞中的细胞黏附分子以及导致炎症反应加重的其他细胞因 子的表达（WadaH.等人，Increasedplasmalevelofinterleukin_6indisseminated intravascularcoagulation,BloodCoagul.Fibrinolysis, 1993,4(4);第 583-590 页； Qin,S.等，RoleofHMGBlinapoptosis-mediatedsepsislethality,J.Exp.Med. ,2006, 203 (7)，第1637-1642页）。从淋巴细胞和单核细胞分泌的炎性细胞因子IL-6在败血症发病 后 6 小时达到最高水平（Hotchkiss，R.S.，等，Apoptosisandcaspasesregulatedeath andinflammationinsepsis.Nat.Rev.Immunol. ,2006,6(11),第 813-822 页）。 因此，已经有抑制伴随并刺激炎症的炎性介质如TNF-a、IL-6、IL-1、IL-8等的 大量尝试，例如抗炎剂如NSAIDS;或者抑制细胞因子的释放的大量尝试，例如TLR4选择性 抑制剂如来自TakedaPharm.CompanyLimited的TAIC-242?和来自EisaiCo.Ltd?的 Eritorail?。但是治疗具有一些缺点，例如有限的功效等。 最近美国和欧洲批准的重度败血症的单一治疗剂Xigris?(Elilillyand company)已经用来治疗重度败血症，但是它也具有缺点，例如有限的适应症和功效、不良反 应如严重的出血或中风等（R.PhillipDellinger等，Importantissuesinthedesign andreportingofcinicaltrilasinseveresepsisasacutelunginjury,Journal ofCriticalCare.，23,第 493-499 页，2008 ;www.fda.gov。） 因此，目前仍需要开发具有强效和较小毒性的新的抗败血症药物，并且尝试由在 韩国因为无毒性而频繁被开处方和使用的自然资源开发有效的药物。 已经报道分布于韩国的忍冬的花包含木犀草素、肌醇、皂苷、单宁、异绿原酸、绿原 酸等（B.S.CHUNG等，Dohaehyangyakdaesajeon，Youngrimpress，第 939-940 页，1998)。 但是，在以上所引用文献的任何一个中都未报道或公开忍冬的纯化花提取物对败 血症的治疗性效果或改善性效果，上述文献的公开通过引用并入本文。 为了研究用于制备含有大量活性成分、如绿原酸及其衍生物的忍冬的纯化花提取 物的新方法，和研究忍冬的纯化花提取物对败血症的治疗效果，本专利技术的专利技术人已经深入 地进行了组分分析以及一些动物模型试验，例如重度败血症CLP模型试验，对MODS的效果， 对各种促炎性细胞因子如TNF-a、IL-1P、IFN-y等的抑制效果，最终通过确认花 提取物的纯化提取物包含大量活性成分并显示出对败血症和败血性休克有效地治疗效果 完成了本专利技术。 通过下文中提供的本专利技术的详细公开，本专利技术的这些及其他目的会变得明显。
技术实现思路
技术问题 因此，本专利技术的一个目的是提供一种用于制备忍冬的纯化提取物的方法，其包括 以下步骤：在第一步骤，利用提取溶剂对忍冬的干花材料进行提取；在第二步骤，使粗制提 取物经受选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理，优选过滤法以提供忍冬的粗制提取 物；在第三步骤，通过添加水使粗制提取物悬浮于水中以制备悬浮溶液，然后将该溶液分级 成非极性溶剂可溶部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质并通过收集剩余物提 供第一纯化提取物；在第四步骤，将水添加至第一纯化提取物以使其经受选自使用与水的 量相等的量的吸附树脂的吸附色谱、离子柱色谱或其组合的至少一种纯化过程，和用清洗 溶剂反复地清洗以提供忍冬的第二纯化提取物；和真空下对该提取物进行浓缩，并干燥以 提供忍冬的纯化提取物，所述提取物含有大量的活性成分，具体地，含有基于干燥的纯化提 取物的重量的2. 0%至30. 0% (重量/重量）、优选5. 0%至20. 0% (重量/重量）、更优 选7.0%至15.0% (重量/重量）的量的绿原酸及其衍生物。 在本专利技术的一个优选实施方案中，上述方法中第一步骤的提取溶剂包括基于花材 料重量的约1至100倍、优选2至20倍、更优选5至15倍体积（体积/重量）的至少一种 溶剂，该至少一种溶剂选自水、酒精制剂、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、己烷、乙酸乙酯、环己烷、 DMS0、氯仿和二氯甲烷，优选地选自水、甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，更优选水，最优选使基于花 材料的重量的〇. 1 %至5%、优选0. 2%至2%重量（重量/重量）的量的弱碱如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备忍冬的纯化提取物的方法，其包括以下步骤：在第一步骤，利用提取溶剂对忍冬的干花材料进行提取；在第二步骤，使粗制提取物经受选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理，以提供忍冬的粗制提取物；在第三步骤，通过添加水使所述粗制提取物悬浮于水中以制备悬浮溶液，和将该溶液分级成非极性溶剂可溶部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质并通过收集剩余物提供第一纯化提取物；在第四步骤，将水添加至所述第一纯化提取物以使其经受选自使用与水的量相等的量的吸附树脂的吸附色谱、离子柱色谱或其组合的至少一种纯化过程，和用清洗溶剂反复地清洗以提供忍冬的第二纯化提取物；和真空下对所述提取物进行浓缩，并干燥，以提供含有大量的活性成分的忍冬的纯化提取物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.27 KR 10-2012-00444411. 一种用于制备忍冬的纯化提取物的方法，其包括以下步骤：在第一步骤，利用提取 溶剂对忍冬的干花材料进行提取；在第二步骤，使粗制提取物经受选自过滤法、离心或其组 合的至少一种处理，以提供忍冬的粗制提取物；在第三步骤，通过添加水使所述粗制提取物 悬浮于水中以制备悬浮溶液，和将该溶液分级成非极性溶剂可溶部分和极性溶剂可溶部分 以除去非极性可溶物质并通过收集剩余物提供第一纯化提取物；在第四步骤，将水添加至 所述第一纯化提取物以使其经受选自使用与水的量相等的量的吸附树脂的吸附色谱、离子 柱色谱或其组合的至少一种纯化过程，和用清洗溶剂反复地清洗以提供忍冬的第二纯化提 取物；和真空下对所述提取物进行浓缩，并干燥，以提供含有大量的活性成分的忍冬的纯化 提取物。2. 根据权利要求1所述的方法，其中第一步骤的所述提取溶剂包括基于花材料重量的 1至100倍体积（体积/重量）的至少一种溶剂，所述至少一种溶剂选自水、酒精制剂、甲 醇、乙醇、丙醇、丁醇、己烷、乙酸乙酯、环己烷、DMSO、氯仿和二氯甲烷。3. 根据权利要求1所述的方法，其中第一步骤的所述提取溶剂包括1至100倍体积的 碱性溶液，所述碱性溶液是使基于花材料重量的0. 1 %至5 %重量（重量/重量）的量的弱 碱，例如NaHC03、NaC03等溶解于水以提高提取效率。4. 根据权利要求1所述的方法，其中通过选自热水回流提取、花香提取、索氏提取、超 声波提取及其组合的至少一种提取方法来进行第一步骤的提取过程。5. 根据权利要求1所述的方法，其中通过选自过滤法、离心或其组合的至少一种处理 来进行第二步骤的提供忍冬的粗制提取物的所述处理。6. 根据权利要求1所述的方法，其中通过以下过程来进行第三步骤的提供第一纯化提 取物的过程：添加约0. 005至5倍体积的水（体积/重量，基于所述粗制提取物的重量）以 制备所述悬浮溶液；和通过添加约〇. 1至50倍体积的非极性溶剂（体积/体积，基于所述 悬浮溶液的体积），例如己烷、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯，将该溶液分级成非极性溶剂可溶 部分和极性溶剂可溶部分以除去非极性可溶物质。7. 根据权利要求1所述的方法，其中通过以下过程来进行第四步骤的提供忍冬的第 二纯化提取物的过程：将1至30倍重量的水（重量/重量，基于所述第一纯化提取物的重 量）添加至所述第一纯化提取物以使其经受吸附色谱来进一步纯化，所述吸附色谱使用选 自 SP207、HP20SS、Diaoion HP20、SP-850 树脂、活性炭、或 Amberlite XAD-2,4 的至少一种 树脂并且吸附树脂的量与水的量相等。8. 根据权利要求1所述的方法，其中通过经受离子柱色谱来进行第四步骤的提供 忍冬的第二纯化提取物的过程，所述离子柱色谱使用选自AG50W-X8、Amberlte IR-120、 Amberlite IRA-400、Dowex 50W_x8 或 SK1B 的至少一种强酸性树脂，选自 Amberlte IRC-50、Bio-Rex 70、Duolite-436或WK40的至少一种弱酸性树脂，或者选自Amberlte IR-67或Dowex 3_x4的至少一种弱喊性树脂，优选选自Amberlte IR-120、Amberlite IRA-400或SK1B的至少一种强酸性树脂，并且离子树脂的量与水的量相等。9. 根据权利要求1所述的方法，其中通过重复地用选自水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其 混合物的至少一种清洗溶剂清洗吸附到树脂的吸附物质来进行第四步骤的提供忍冬的第 二纯化提取物的所述清洗过程。10. 根据权利要求1所述的方法，其中第四步骤的提供忍冬的第二纯化提取物的所述 清洗过程进行至除第四步骤的纯化过程外的另外的葡聚糖凝胶柱色谱，所述葡聚糖凝胶柱 色谱使用选自Sephadex LH-20树脂、Sephadex G15树脂或Sephadex G35的至少一种葡聚 糖凝胶树脂。11. 根据权利要求1所述的方法，其中通过以下过程进行第五步骤的提供忍冬的纯化 提取物的浓缩过程和干燥过程以提供忍冬提取物的创造性纯化提取物：在10°c至80°C的 温度在真空下浓缩所述提取物，和通过选自室温干燥法、冷冻干燥法、热空气干燥法或其组 合的至少一种干燥方法来干燥所述提取物。12. -种忍冬的纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹圣泰，金桢熏，林芳虎，金映睦，延成钦，金炫锈，李善美，
申请(专利权)人：休恩有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR