一种枯草芽孢杆菌制造技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZK1-18，保藏编号CGMCC No.9402。本发明专利技术的枯草芽孢杆菌ZK1-18菌株源于土壤，该菌株生态安全，无腐蚀，对人畜动植物无害，该菌株是以有机磷源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变有机磷的性质，使有机磷的组分发生变化，起到解磷作用。本发明专利技术的菌株为后续研制具有降解土壤有机磷功效的生物有机肥提供高效、稳定的菌种及基础资料。

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种枯草芽孢杆菌。
技术介绍
磷元素是植物生长的一种主要营养元素，在土壤中主要以难溶的矿物形态存在，导致植物对土壤中的磷元素利用率很低，影响植物的生长。我国对解磷菌的研究起步于20世纪50年代，解磷菌能将植物难以吸收利用的难溶性或不溶性磷转化为可利用的形态，提高土壤中磷素的利用效率，减少化学肥料的施用，降低农业投入成本，因此对土壤环境进行微生物修复，是提高作物产量，解决土壤速效磷缺乏的重要途径之一。然而，现在我国对解磷菌的研究主要集中于溶解无机磷菌株的筛选，对于土壤难溶性有机磷解磷菌的研究却鲜有报道。有机磷是土壤磷的重要组成部分，一般占土壤全磷的20％～50％。土壤的微生物修复技术，近十几年来在国外得到了较大发展，但是土壤有机磷降解速度缓慢，致使治理过程延续时间较长，一直是这项技术的一个突出难点，因此寻找高效有机磷降解菌，将土壤中植物难以吸收利用的有机磷转化为可吸收利用的形态，是当前磷污染土壤微生物修复技术的研究热点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种枯草芽孢杆菌。该菌株源于土壤，生态安全，无腐蚀，对人畜动植物无害，该菌株是以有机磷源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变有机磷的性质，使有机磷的组分发生变化，起到解磷作用。该菌株为后续研制具有降解土壤有机磷功效的生物有机肥提供高效、稳定的菌种及基础资料。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为BacillussubtilisZK1-18，保藏编号CGMCCNo.9402，保藏日为2014年6月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。1、该菌株具有如下的性质：形态特征：杆状，大小(0.5～0.8)μm×(1.8～2.2)μm，芽孢中生或近中生。菌落圆形，白色、表面干燥有褶皱、无光泽、不透明，边缘不光滑。生理生化特征：革兰氏阳性细菌。2、该菌株的筛选方法为：步骤一、富集：从西安市雁塔区西安文理学院生物技术学院无花果园土壤表层以下5cm～10cm采集土样100g左右，将采得的土样放入纸袋中带回实验室分离。以无菌方式称取土样10.0g放入含有100.0mL富集培养基(已灭菌)的250mL的三角瓶中，于30℃，140r/min恒温摇床富集培养5d；然后吸取5mL培养液重新转接入新鲜的富集培养基中，再进行3次富集培养，每次5d；所述富集培养基的组成为：葡萄糖3.506g，蛋白胨0.83g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾0.35g，碳酸钙0.25g，卵磷脂0.02g，蒸馏水1000mL，培养基pH值6.8～7.1，105KPa灭菌20min～25min；步骤二、筛选和纯化：将步骤一中3次富集培养后的富集培养液按十倍稀释法稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75个稀释度的培养液各0.1mL涂布于有机磷固体平板培养基中，每个稀释度涂布3块平板，置于28℃恒温培养箱内培养5d，能产生溶磷圈(透明圈)的菌株即为解磷细菌，将溶磷圈较大的菌株在有机磷固体培养基平板上进行多次划线纯化，以纯化得到形态一致的纯化菌株，然后将纯化菌株转接到基础培养基斜面上，于28℃培养箱中培养2d，置于4℃冰箱中保存待用；所述基础培养基的组成为：葡萄糖3.506g，蛋白胨0.83g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾0.35g，碳酸钙0.25g，琼脂16g～20g，蒸馏水1000mL；所述有机磷固体平板培养基的组成为：基础培养基，卵黄液60mL，培养基pH值自然；有机磷固体平板培养基的制法：将1000mL灭菌后的基础培养基冷却到50℃以下，立即加入60mL新鲜配制的卵黄液后移入平板；卵黄液制备：以酒精擦净鸡蛋外壳，用解剖刀切破鸡蛋两端，流去卵清后将卵黄流入已灭菌的锥形瓶中，约加等量无菌生理盐水摇匀；步骤三、复筛：将步骤二中保存的菌株活化后得到菌悬液，将菌悬液滴加到有机磷固体平板培养基中，以1μL无菌水为对照，重复3次，28℃条件下培养5d，用直尺测量溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)，并根据是否产生溶磷圈以及D/d值的大小来初步确定菌株的解磷能力(D/d值越大解磷能力越好)；然后将解磷能力好的菌株接种于50mL蒙金娜有机磷液体培养基中，以等体积的无菌水为对照，重复3次，摇床培养(28℃、120r/min)7d后，8000r/min离心15min，取上清液5mL，进行超声波破碎细菌细胞(200W，20min)，使之释放出细菌细胞内的有效磷，用钼锑抗比色法测定PO3-4含量，保存PO3-4含量最高的菌株，命名为ZK1-18；所述的蒙金娜有机磷液体培养基的制备方法为：向1000mL灭菌后的蒙金娜培养基中加入0.2g用无水乙醇溶解的经过滤和灭菌的卵磷脂，其中蒙金娜培养基的组成为：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O0.3g，NaCl0.3g，KCl0.3g，FeSO40.03g，MnSO4·H2O0.03g，蒸馏水1000mL，105KPa灭菌20min～25min。3、该菌株的鉴定方法为：(1)形态学鉴定：将筛选出来的菌株ZK1-18在琼脂平板上培养，观察细菌菌落生长特征，注意其形状、大小、颜色、透明度、边缘特征等，并作记录；同时用接种环挑取单菌落进行革兰氏染色，镜检，记录结果。结果：ZK1-18菌株呈杆状，大小(0.5～0.8)μm×(1.8～2.2)μm，芽孢中生或近中生。菌落圆形，白色、表面干燥有褶皱、无光泽、不透明，边缘不光滑，革兰氏染色呈阳性。(2)生理生化鉴定：生理生化实验按照伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)方法进行，结果见下表。表1ZK1-18菌株的生理生化特征特征ZK1-18菌株特征ZK1-18菌株明胶水解试验+脂肪水解－VP反应+尿素试验－接触酶试验+吲哚试验+过氧化氢酶+葡萄糖产酸+柠檬酸盐试验－葡萄糖产气+淀粉水解+注：表中“+”为阳性，“－”为阴性。(3)16SrDNA的扩增与测序：步骤一：细菌总DNA提取：取1mL过夜培养的ZK1-18细菌(3×108个)菌液，放入1.5mL的离心管中，室温下8000r/min离心1min，弃上清；重悬沉淀于1.0mL的质量分数为0.85％的NaCl溶液，4℃，13000r/min离心5min，弃上清，加400μLTE重悬菌体，加入20μL溶菌酶溶液(20mg/mL溶菌酶，20mMTris-HClpH8，2.5mMEDTA，1％TritonX-100)37℃过夜；加400μLCTAB提取液，轻轻摇匀，65℃水浴40min(每10min轻摇一次)；冷却至室温，加400μL酚氯仿混液(V酚:V氯仿＝1:1)，轻轻摇匀，12000r/min，4℃离心10min；移上清至1.5mL新离心管，加等体积氯仿异戊醇混液(V氯仿:V异戊醇＝24:1)，混匀，12000r/min，4℃离心10min；移上清至1.5mL新离心管，加等体积冰冻异丙醇，-20℃静置60min沉淀DNA，12000r/min，4℃离心10min，弃上清，加500μL体积分数为75％的乙醇，颠倒数次，离心，重复2次；倒置离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis ZK1‑18，保藏编号CGMCC No.9402。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为Bacillu...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵咏梅，
申请(专利权)人：西安文理学院，
类型：发明
国别省市：陕西;61