α转移葡萄糖苷酶及其重组表达菌株制造技术

本发明专利技术涉及一种新型的α转移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。用于重组表达该α转移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus niger）At3，其保藏编号为CGMCC No.6923。本发明专利技术所得到的重组菌种能够表达α转移葡萄糖苷酶，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表达的α转移葡萄糖苷酶的酶活力。同时，所得重组α转移葡萄糖苷酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，扩大了α转移葡萄糖苷酶的应用领域。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种新型的α转移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:?1。用于重组表达该α转移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus?niger）At3，其保藏编号为CGMCC?No.6923。本专利技术所得到的重组菌种能够表达α转移葡萄糖苷酶，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表达的α转移葡萄糖苷酶的酶活力。同时，所得重组α转移葡萄糖苷酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，扩大了α转移葡萄糖苷酶的应用领域。【专利说明】ct转移葡萄糖苷酶及其重组表达菌株
本专利技术属于酶分离表达
，具体涉及一种来源于土曲霉（Aspergillus terreus)的新型的α转移葡萄糖苷酶，以及该α转移葡萄糖苷酶在丝状真菌宿主细胞 (诸如黑曲霉（Aspergillus niger)中的异源表达。
技术介绍
α转移葡萄糖苷酶（a-transglucosidase E. C. 2. 4. 1. 24)能够从低聚糖类底 物的非还原性末端切开α-1、4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基以α-1、 6糖苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖（简称頂0,主要 包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等）、糖脂或糖肽等。该酶既具有水解能力，又可以专一地 进行葡萄糖苷键的转移反应，是生产低聚异麦芽糖的必需酶制剂之一。 α转移葡萄糖苷酶在自然界中分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生 物体内，在人类的糖原降解及动物、植物和微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。α 转移葡萄糖苷酶主要应用于生产頂〇,而頂〇是人类肠道有益菌群双歧杆菌的增殖因子，摄 入后不被人体消化吸收，也不易被大肠中的多数腐败细菌所利用，却能作为双歧杆菌的碳 源而被利用。因此作为一种功能性食品原料，頂〇已被广泛用在各种食品的制造，居各种功 能性低聚糖之首。 目前工业上已经有以淀粉或麦芽糖为原料，通过酶法生产低聚异麦芽糖的工艺， 但是已有的生产工艺转化率并不高。此外，虽然我国异麦芽糖产量很高，α转移葡萄糖苷 酶的用量很大，但是没有工业化生产，该酶仍然依赖进口。因此，本领域亟需获得高纯度的 转化活性较高的低聚异麦芽糖，提高生产工艺的转化效率；也亟需获得相应的高活性的α 转移葡萄糖苷酶及其相应的生产菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种α转移葡萄糖苷酶及其重组表达菌株，从而弥补现有 技术的不足。 本专利技术一个方面提供一种新型的α转移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQ ID Ν0: 1〇 本专利技术的另一个方面提供用于编码上述α转移葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序 列为 SEQ ID Ν0: 2。 本专利技术的α转移葡萄糖苷酶，是从土曲霉中扩增出的。 本专利技术还提供用于表达上述α转移葡萄糖苷酶的曲霉菌株； 一种表达α转移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus niger)At3,已于2012年11 月30日保存于位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，菌株编号为CGMCC No. 6923。 本专利技术的α转移葡萄糖苷酶和重组黑曲霉菌株用于生产低聚异麦芽糖。 本专利技术所得到的重组菌种能够表达α转移葡萄糖苷酶，其酶活力大大高于其在 野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表达的α转移葡萄糖苷酶的酶活力。同时，所 得重组α转移葡萄糖苷酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，扩大了 α转移葡萄糖苷酶的 应用领域。 【专利附图】【附图说明】 图1 :本专利技术所使用的pGm质粒的遗传图谱； 图2 :黑曲霉（Asperillus niger) At3的发酵液蛋白SDS-PAGE凝胶图，显示了黑 曲霉转化子At3的表达情况，以及野生菌和宿主菌黑曲霉G1的蛋白表达情况，其中泳道1 所示为蛋白标准分子量标记，由上至下为116. 0 kD，66. 2 kD，45. 0 kD，35. 0kD，25. OkD和 18. 4kD ;泳道2所不为黑曲霉宿王G1在发酵5d后的蛋白表达情况；泳道3所不为At3的 α转移葡萄糖苷酶表达情况，在107kDa处可以看到清晰蛋白条带；泳道4所示为野生菌的 蛋白表达情况。 【具体实施方式】 本专利技术用到了在遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法。例如 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)等参考书中所记载的技术。但是，这 并不意味着将本专利技术限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，本领域的普通技术人 员可以选用已公开的技术来实施本专利技术实施例中记载的方案。 本专利技术说明书中记载的低聚异麦芽糖和异麦芽低聚糖可互换使用，都指选自下组 的一种或多种糖：异麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、或潘糖。此外，应理解，所述的术语还 包括上述糖的混合物。 本专利技术所记载的α转移葡萄糖苷酶，又称为α-D-葡萄糖苷水解酶，能切开麦芽 糖和麦芽低聚糖分子结构中α -1，4糖苷键，并能将游离出来的一个葡萄糖残基转移到另 一个葡萄糖分子或麦芽糖或麦芽三糖等分子中的α -1，6位上，其转糖苷作用可将低聚糖 中的α-1，4糖苷键转化成α-1，6糖苷键或其他形式的链接，从而得到非发酵性的低聚异 麦芽糖或糖酯、糖肽等。 基因指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片 段（外显子）之间的插入序列（内含子）。 核酸包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物；核酸与多核苷酸在本 说明书中可以互换使用。 本专利技术中的酶表达的分析和酶活力的测定的方法如下： 为了评价α转移葡萄糖苷酶的表达，可以在蛋白水平或核酸水平进行分析。可以 应用的分析方法包括Northern印迹、斑点印迹（DNA或RNA分析）、Southern印迹、放射自 显影、RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应）和含有适当标记的探针（基于核酸编码序列）进 行的原位杂交。此外，基因表达可以通过免疫学方法，诸如细胞、组织切片的免疫组织化学 染色或者组织培养基的免疫试验。例如通过Western印迹或ELISA来评估。这样的免疫试 验可以用于定性地和定量地评价α转移葡萄糖苷酶（诸如At3)的表达。此类方法的细节 是本领域技术人员已知的，并且用于实施此类方法的许多试剂是可商业获得的。在一些实 施方式中，α转移葡萄糖苷酶（诸如At3)的表达通过SDS-PAGE进行分析。 α转移葡萄糖苷酶（诸如At3)的活性测定采用HPLC方法，既可以使用淀粉为原 料，也可以使用麦芽糖为原料，根据生成的异麦芽糖、潘塘等低聚糖的量来判定酶活高低。 一种优选的测定方法包括：以淀粉为原料（浓度1〇%~40%)，经高温α淀粉酶（〇. 059Γ0. 5%) 在90°C ~115°C液化到DEKT20,煮沸5分钟?15分钟灭酶，冷却到60°C，调pH到4~7,加普 鲁兰酶（0. 05%?0. 5%)、α 真菌淀粉酶（〇. 〇5%?0. 5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α转移葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的α转移葡萄糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王华明，訾祯祯，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12