一种手性纯S-乙偶姻的生产方法，包括如下步骤：将丁二酮还原酶基因(dar)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh)在大肠杆菌中共表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮和葡萄糖为底物转化生产手性纯S-乙偶姻。丁二酮还原酶具有催化丁二酮生成手性纯S-乙偶姻的特性，而葡萄糖脱氢酶能够提供丁二酮还原酶所需的辅酶NADH，S-乙偶姻的产量可达28g/L，光学纯度为99.7％。本发明专利技术方法培养基简单，操作过程简便，产物S-乙偶姻分离方便，不需要复杂的手性拆分步骤，并且实现胞内辅酶再生，成本低，极具工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种手性纯S-乙偶姻的生产方法
本专利技术涉及，具体说是将丁二酮还原酶基因 dar 和葡萄糖脱氢酶基因 gdh在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化 齐IJ，以丁二酮和葡萄糖为底物高效生产手性纯S-乙偶姻的方法。
技术介绍
乙偶姻（acetoin)具有明显的奶酪香、脂香特征，天然地存在于玉米、葡萄、苹果、 草莓、黄油、干酪、酒类、可可等各类食品中，国家标准GB2760-86规定其为允许添加食用 的食品香料。乙偶姻主要用于奶油、乳品、咖啡、酸奶等香料的生产。此外，乙偶姻是一种 重要的化学合成中间体，2004年美国能源部将乙偶姻列为30种优先开发利用的平台化合 物之一，可广泛应用于食品、制药、化工等领域。乙偶姻有两种旋光异构体（S-乙偶姻和 R-乙偶姻），除了上述应用之外，具有立体结构专一性的手性乙偶姻还有特殊的用途，例如 合成手性液晶复合材料。在制药工业中，手性乙偶姻可作为前体合成重要药物中间体，如 4-氯-4, 5-二甲基-1，3-二氧杂环戊烷-2-酮（CDMD0)和4-溴甲基-5-甲基-1，3-二氧 戊环-2-酮。4-溴甲基-5-甲基-1，3-二氧戊环-2-酮是合成抗菌药伦氨苄西林盐酸的中 间体。CDMD0主要用于青霉素、氨苄青霉素等抗生素类药物的修饰，以合成具有光学活性的 手性药物，较大程度地提高药效，减轻药物的副作用。 手性乙偶姻的生产方法主要分为两类：化学合成法与生物合成法。化学法合成法 过程繁琐，最后还需要进行复杂的手性拆分，存在成本高、收率低、光学纯度低、高能耗、高 污染的问题，且原料来源于不可再生的化石资源--石油，原料来源受到限制。 生物合成法是一种十分具有发展前景的环境友好合成方法，近年来受到了越来越 多的关注。然而，天然微生物发酵产生的一般都是S-乙偶姻和R-乙偶姻的旋光异构体混 合物，发酵产物手性拆分工艺繁琐，成本高昂。因此，人们尝试构建重组大肠杆菌生物催化 剂来合成S-乙偶姻。休止细胞催化是指利用完整的休止细胞作为生物催化剂进行生物 转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化，综合了发酵法和酶法催化这两种技术的优点，克 服了发酵法存在的诸多缺点。研究者通过构建重组大肠杆菌异源表达来自于枯草芽孢杆 菌（Bacillus subtilis)的（R，R) _2, 3_ 丁二醇脱氧酶和来自于短乳杆菌（Lactobacillus brevis)的NADH氧化酶，获得能够催化手性纯meso-2, 3- 丁二醇成为S-乙偶姻的重组大 肠杆菌休止细胞生物催化剂，产物光学纯度为96%【专利申请号：CN200910013902. 8 ;PL〇S ONE, 2010, 5:e8860】。但是，上述的休止细胞催化反应均需要使用工业难以制备的前体-- 手性纯meso-2, 3- 丁二醇。丁二酮价格远远低于手性纯meso-2, 3- 丁二醇，若能利用其为 前体合成光学纯S-乙偶姻，则能有效降低S-乙偶姻的生产成本，从而更具有商业化应用前 旦 -5^ 〇 研究者尝试使用纯酶催化还原丁二酮的方法制备手性纯S-乙偶姻，他们通过构建 重组大肠杆菌分别表达氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans)DSM2003的丁二酮还 原酶和B. subtilisl68的葡萄糖脱氢酶。这两株重组大肠杆菌经过诱导表达目的产物后， 收集细胞进行破碎，然后通过酶分离纯化获得条带单一的丁二酮还原酶和葡萄糖脱氢酶。 利用纯化的丁二酮还原酶偶联纯化的葡萄糖脱氢酶组成催化体系，在加入辅酶NADPH的条 件下，可催化丁二酮产生手性纯S-乙偶姻【Bioresource Technol.，2013, 137:111-115】。 纯酶催化的方法具有产物分离纯化简便的优点，但需要破碎细胞和分离纯化酶，而且需要 加入昂贵的辅酶NADPH，工艺繁琐，成本较高。 多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)的丁二酮还原酶在NADH存在下可 以催化丁二酮还原为 S-乙偶姻【Appl. Environ. Microbiol.，2011，77:4230-4233】。两株 P. polymyxa(ATCC12321和ZJ-9)的dar基因已被证明编码丁二酮还原酶【4口口1』11￥；[1'〇11· Microbiol.，2011，77:4230-4233 ;Lett.Appl. Microbiol.，2013, 57:274-281】，但目前尚未 有P. polymyxa DSM365菌株dar基因的相关信息报道。2013年，Gao等在大肠杆菌中表达 P. polymyxa ZJ-9的丁二酮还原酶，可获得能够催化丁二酮产生手性纯S-乙偶姻的重组大 肠杆菌休止细胞生物催化剂【Acta Biotechnol，2002, 22:355-362】，但该研究没有偶联葡 萄糖脱氢酶催化辅酶NADH再生。 经广泛的文献和专利检索，我们发现来源于枯草芽孢杆菌168的葡萄 糖脱氧酶基因 gdh，作为辅酶在文献Engineering of cofactor regeneration enhances (2S，3S)-2, 3-butanediol production from diacetyl·中已被报道[SCIENTIFIC REPORTS. ,2013,3:1-6]。但迄今为止尚未有关于P. polymyxa DSM365菌株丁二酮还原酶基 因（dar)的报道；而将该基因与葡萄糖脱氢酶基因（gdh)在大肠杆菌中进行共表达，并以此 重组菌株制备休止细胞生物催化剂实现偶联丁二酮还原和辅酶NADH再生的S-乙偶姻生产 方法，国内外亦无公开文献专利报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种手性纯S-乙偶姻的生产方法，它能够克服现有方法存 在工艺繁琐、产量低、光学纯度低、成本高的缺陷。 本专利技术是利用丁二酮还原酶可以立体专一的催化丁二酮生成手性纯S-乙偶姻， 以及葡萄糖脱氢酶能够实现胞内辅酶NADH再生的性质，将丁二酮还原酶基因（dar)和葡萄 糖脱氢酶基因（gdh)导入大肠杆菌中进行共表达，以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化 剂转化丁二酮，实现手性纯S-乙偶姻的高效低成本合成。 本专利技术所述生产手性纯S-乙偶姻的方法，是将丁二酮还原酶基因（dar)和葡萄 糖脱氢酶基因（gdh)导入大肠杆菌中进行共表达，以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化 齐IJ，以丁二酮为前体，葡萄糖为辅酶再生原料，实现手性纯S-乙偶姻的高效低成本合成。 其中：所述丁二酮还原酶基因可来源于多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca)、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes)、粘质沙雷菌（Serratia marcescens)、解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)和地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis) 〇 进一步的，所述丁二酮还原酶基因来源菌株优选是Paenibacillus polymyx本文档来自技高网...
【技术保护点】
丁二酮还原酶基因dar，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1. 丁二酮还原酶基因 dar，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -种手性纯S-乙偶姻的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述丁二酮还原 酶基因 dar以及葡萄糖脱氢酶基因 gdh在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞 为生物催化剂，以丁二酮为前体转化生产手性纯S-乙偶姻。3. 如权利要求2所述的手性纯S-乙偶姻的生产方法，其特征在于，所述以重组大肠杆 菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮为前体转化生产手性纯S-乙偶姻的方法，包含如下步 骤： (1) 平板培养：将重组大肠杆菌划线到含有质量体积比为1. 5?1. 8%琼脂的并含有 100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养12小时； (2) 种子培养：在无菌的条件下，用牙签挑取步骤（1)平板上的一个单菌落，然后接种 到10?100mL的含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，25?40°C过夜培养； (3) 发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤（2)所得的菌液以体积比为1?10%的接种量 接种到0. 5?10L的含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，25?40°C培养2? 10小时，然后再加入终浓度为〇. 1?3mM的IPTG，10?37°C诱导5?24小时，得到一种培 养物； 其中，上述步骤（1)?（3)中所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/ LNaCl，121°C条件下灭菌15分钟； (4) 收集菌体：将步骤（3)培养得到的培养物5, 000?8, OO...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢能中，黄日波，李检秀，黄艳燕，郭铃，杜奇石，陈东，李亿，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：广西;45
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