本发明专利技术公开了一株基因工程菌，该菌命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09，其已于2014年5月7日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC NO：M2014186。本发明专利技术还公开了所述基因工程菌在利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。实验证明本发明专利技术菌株具有明显利用秸秆水解液高产(2R,3R)-2,3-丁二醇的能力，为工业上规模化开发利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇提供基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株基因工程菌及其在生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用，尤其涉及一株基因工程阴沟肠杆菌及其在利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。
技术介绍
2,3-丁二醇广泛应用于化工、食品、燃料及航天航空等多个领域(Syu M J.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2001,55,10-18)。2,3-丁二醇在常温下是一种无色无味的液体，有三种同分异构体：meso-2,3-丁二醇、(2R,3R)-2,3-丁二醇和(2S,3S)-2,3-丁二醇；其中旋光性的(2R,3R)-2,3-丁二醇在手性化合物的不对称合成中有着重要作用，而且能够作为防冻剂使用(Celinska and Grajek,Biotechnol.Adv.2009,27,715–725)。木质纤维素由于其可替代性和可循环性，被认为是利用微生物生产化学品的理想原料(Ji et al.,Biotechnol.Adv.2011,29,351–364)。因此，近年来关于利用源自木质纤维素的糖类生产2,3-丁二醇的生物技术得到广泛关注(Wang et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2010,87,965–970)。木质纤维素水解液中主要含有葡萄糖和木糖，由于葡萄糖的存在会抑制2,3-丁二醇生产微生物对木糖的利用，往往会降低木质纤维素水解液原料的利用效率，从而造成2,3-丁二醇生产成本的提高。已有报道通过表达环磷酸腺苷受体蛋白(CRP)突变蛋白实现木糖和葡萄糖的同时利用来生产2,3-丁二醇(Ji et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2011,89,1119–1125)，但由于产量和生产强度较低，无法满足工业生产需求。目前报道的众多生产2,3-丁二醇的野生菌株中，仅多粘类芽孢杆菌产生光学纯的(2R,3R)-2,3-丁二醇，该菌株以葡萄糖为碳源，补料分批发酵能够产生111.0克/升的(2R,3R)-2,3-丁二醇，纯度达到98％，为目前报道(2R,3R)-2,3-丁二醇的最高产量，但其需要高浓度的有机氮源(et al.,Bioresour.Technol.2012,124,237–244)，增加了生产成本。在生产(2R,3R)-2,3-丁二醇基因工程菌方面，大肠杆菌工程菌能够利用葡萄糖产9.5克/升的(2R,3R)-2,3-丁二醇，产量较低(shen et al.,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2012,39,1725–1729)；而酿酒酵母能够补料分批发酵利用葡萄糖和半乳糖产生100.0克/升的(2R,3R)-2,3-丁二醇，纯度达到98％，其生产强度仅为0.33g/[L h](Lian et al.,Metab.Eng.2014,23,92–99)。并且上述菌株由于木糖利用能力较弱，不能有效的利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇。基于此，迫切需要寻找更好的方法，以实现利用木质纤维素水解液来进行(2R,3R)-2,3-丁二醇的高效生产。
技术实现思路
针对上述现有技术中，菌株利用木质纤维素水解液困难，(2R,3R)-2,3-丁二醇的产量低，难以大规模生产的不足，本专利技术要解决的问题是提供一株可利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其在生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。本专利技术所述的基因工程菌为基因工程阴沟肠杆菌，该菌命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09，其已于2014年5月7日保藏于“中国典型培养物保藏中心”(中国.武汉.武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO：M2014186。上述基因工程菌阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，该菌的较佳培养温度为30±1℃，可以在含有50毫克/升硫酸卡那霉素的LB培养基上生长。上述基因工程菌阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09由以如下方法构建。在阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM CGMCC No.4230中，利用基于同源重组的pK-bdh质粒，敲除E.cloacae SDM CGMCC No.4230中的bdh基因，得到的重组菌命名为菌株阴沟肠杆菌SDM01；利用PCR扩增得到短小芽孢杆菌的(2R,3R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bpbdh和E.cloacae SDM CGMCC No.4230中的Pb启动子，并通过重组PCR，酶切和连接，构建pET-Pb-bpbdh，其中Pb-bpbdh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；为了消除碳代谢阻遏，利用pK-ptsG质粒，敲除阴沟肠杆菌SDM01中的ptsG基因，得到的重组菌命名为阴沟肠杆菌SDM03；利用PCR扩增得到E.cloacae SDM CGMCC No.4230中的半乳糖透性酶基因galP和Pb启动子，并通过重组PCR，酶切和连接，构建pET-Pb-galP，其中Pb-galP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，进一步通过重组pCR和酶切连接，得到同时表达bpbdh基因和galP基因的pETPb-bpbdh-PbgalP质粒，其中Pb-bpbdh-PbgalP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；利用pK-frdA和pK-ldhA敲除阴沟肠杆菌SDM03中的frdA和ldhA基因，得到的重组菌命名为阴沟肠杆菌SDM06；将pETPb-bpbdh-PbgalP质粒电转化入阴沟肠杆菌SDM06中，得到的重组菌命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09。本专利技术所述基因工程菌在利用木质纤维素水解液生产(2R,3R)-2,3-丁二醇中的应用。选阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186，对其进行活化。在无菌条件下，取活化好的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09CCTCC NO：M2014186菌液，以体积比为5～10％的接种量接种到发酵培养基中，在温度30±1℃，pH6.0～8.0、搅拌转速100～500rpm、通气量0.5～2.5vvm条件下培养36～72小时，其间，待检测培养基中葡萄糖的浓度降至20克/升以下时，补加木质纤维素水解液至培养基中葡萄糖的浓度为20～50克/升，当检测发酵液中(2R,3R)-2,3-丁二醇的浓度不再增加时，发酵结束，分离出培养液，按常规方式提取(2R,3R)-2,本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为基因工程阴沟肠杆菌，该菌命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09，其已于2014年5月7日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC NO：M2014186。
【技术特征摘要】
1.一株基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为基因工程阴沟肠杆菌，该菌命名
为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)SDM09，其已于2014年5月7日保藏于“中国典...
【专利技术属性】
技术研发人员：马翠卿，李理想，高超，许平，
申请(专利权)人：山东大学，上海交通大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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