本发明专利技术提供了一株产苹果酸基因工程菌EscherichiacoliBA043，其分类命名为大肠埃希氏菌BA043（EscherichiacoliBA043），其保藏登记号为CCTCCNO：M2014034。本发明专利技术还提供了该菌株的构建方法与发酵生产苹果酸的方法，通过敲除或失活富马酸酶和富马酸还原酶，并过量共表达外源丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶，使重组大肠杆菌能够利用葡萄糖代谢生长，减少副产物丙酮酸的生成，从而大幅度提高苹果酸的得率及生产强度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，涉及一种产苹果酸大肠杆菌基因工程菌株及其构建和应用，具体涉及一种高效利用葡萄糖生产苹果酸基因工程菌Escherichia coli BA043的构建及其生产苹果酸的方法。
技术介绍
苹果酸，又叫2-羟基丁二酸，是生物体内三羧酸循环成员之一，分子式为C4H605，分子中有一个手性碳原子，因而有3种存在形式，即D-苹果酸、L-苹果酸和DL-苹果酸。L-型苹果酸广泛存在于自然界中，而化学合成的苹果酸则为L-型和D-型的混合物。由于L-苹果酸可直接由生物体吸收利用，而D-苹果酸是非生理活性的，需要经肝脏的消旋酶和肾脏的氧化还原酶作用，转化成L-苹果酸才能被利用，故生产单一旋光性的苹果酸成为一种诉求。L-苹果酸为无色结晶或粉末，略带刺激性爽快酸味，酸感强度相当于柠檬酸的1.2倍左右，相对密度1.595，熔点100℃，易受潮，易溶于水，微溶于乙醇和醚，加热到180℃可失去水变成富马酸或马来酸。L-苹果酸由于其特异的物理化学性质而广泛应用于食品、医药、化工及其它行业，并具有不可替代性。由于L-苹果酸广泛存在于水果和蔬菜中，早期获取的苹果酸是从水果中提取的，但此方法产量有限，不适用于工业生产。苹果酸的生产方法有化学合成法、直接发酵法(又称一步发酵法)、两步发酵法、酶转化法和直接抽提法，或采用联产L-苹果酸和乳酸及固定化细胞联产L-苹果酸和天冬氨酸生产工艺。化学合成法技术成熟，成本较低，但无法得到单一旋光性的L-苹果酸，限制了其在食品和药品行业的应用，同时，该法对设备要求较高，消耗化石能源，对环境造成污染。目前研究较多的是利用酶转化法和微生物发酵法。酶转化法是利用延胡索酸酶将富马酸转化为苹果酸，但这种方法产量低成本高。相比之下，发酵法则更具有优势。用来发酵制备苹果酸的微生物主要是霉菌，其中黄曲霉Aspergillus flavus为重点研究对象。根据报道，Takao等先用少根根霉(Rhizopus ahirrizus)或华根霉(Rhizopu chinensis)把糖质原料转化成富马酸，然后再用膜醭毕赤酵母(Pichamembrane aefaciens faciens)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)及宛氏拟青霉(Paeciomyces varioti)之一，将富马酸转化成L-苹果酸。国内也在发酵法制备L-苹果酸方面做了长期研究，如山东食品友酵工程实验室刘建军等人(中国食品添加剂，2003，3：52～56)多年来致力于直接发酵法生产L-苹果酸的研究，并且从土壤中分离筛选、诱变获得一株直接利用糖质原料生产L-苹果酸的高产菌株Aspergillus flavus HA5800，经条件优化，7000升发酵罐产酸达8.68%，糖酸转化率达83.5%，发酵周期112小时，为L-苹果酸产业化奠定了基础。利用发酵法产苹果酸可以利用可再生资源来生成苹果酸，不仅摆脱对石化资源的依赖，成本低，污染小，环境友好，且在发酵过程中可吸收大量的CO2，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径。由于大肠杆菌因遗传背景清楚、生长快速、培养条件简单、安全性好、易操作易改造等诸多优点，经改造已成功生产如乳酸、琥珀酸等产品，故有实现苹果酸优质高产工业化生产的现实可行性。提高大肠杆菌的发酵产酸能力有多重途径，包括菌株筛选、理化诱变、基因工程手段、发酵调控等多种方法。Soon Ho Hong等人报道了构建产琥珀酸基因工程菌的方法，原理是敲除野生大肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)和乳酸脱氢酶基因(ldhA)，减少甚至不产副物甲酸、乳酸、乙酸以及乙醇等，使更多的代谢流流向琥珀酸(Biotechnol Bioeng,2001,74:89～95)。在此基础上，如果将下游支路上的FUM和FRD敲除，则可阻断苹果酸流向富马酸继而生成丁二酸的反应，产物可以苹果酸的形式积累。根据本团队先前的授权专利ZL200810023410.2（专利技术名称为“新构建的高产苹果酸工程菌及其生产苹果酸的方法”)，得到一株同时敲除pflB、ldhA、fumB的三敲菌株Escherichia coli JM127。在厌氧条件下，该菌株从苹果酸还原到富马酸的途径被节制，但是经基因改造后，该菌株代谢的所需的辅酶NAD+的再生受到了影响，使得菌株的耗糖能力以及几处关键酶活有所降低，一定程度上限制了菌株的产酸能力。大肠杆菌中NAD(H)的生物合成及分解途径如图2所示，涉及其合成的基因主要有三个（pncB，nadD，nadE），涉及分解代谢的基因主要有两个（yjaD，yrfE），而NAD+和NADH相互之间的转化反应则多达300多个。相关研究表明，利用DNA重组技术改造NAD(H)生物合成途径是提高NAD(H)总量的有效手段。San等人（Metab Eng,2002,4:238-247；Metab Eng,2002,4:182-192）在研究辅因子调控对大肠杆菌代谢流分布的影响过程中，通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶使胞内NAD(H)总量提高了41.7%；Heuser等人（Eng Life Sci,2007,7:343-353）通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶和NAD合成酶，或者同时表达这两个酶，使菌株胞内NAD(H)总量提高了2倍多，并将其应用到酶转化合成(R)-甲基-3-羟基丁胺过程中，使得NAD(H)的量不再成为限制因素，从而提高了酶转化的效率。E.coli JM127由于同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脱氢酶和延胡索酸酶，NADH不能及时再生为NAD+，引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡（NADH/NAD+比例超过2），最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖。因此，在高产苹果酸大肠杆菌菌株构建过程中，确保胞内辅酶NAD(H)的平衡是重组大肠杆菌高产丁二酸的关键因素之一。另外，由于缺失了丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和乳酸脱氢酶基因ldhA，导致丙酮酸的大量积累，反馈抑制PTS糖转运系统对葡萄糖的转运，使得菌体在厌氧条件下不能利用葡萄糖，并且生长受到抑制。Vemuri等人将R.etli中的pyc基因引入NZN111中，结果丙酮酸减少了3倍，丁二酸产量增加了52%。岳方方等人在JM1307中过量表达枯草芽孢杆菌中的pyc基因，结果丁二酸的产量增加了1.9倍，同时丙酮酸的量也有如果能从分子水平上克服不足，恢复菌株的生长耗糖能力。通过外源引入了B.subtilis中的丙酮酸羧化酶基因，使积累的丙酮酸流向草酰乙酸，解除丙酮酸的反馈抑制现象，进而积累苹果酸。丙酮酸羧化酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株产苹果酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌BA043（Escherichia coli BA043），其保藏登记号为CCTCC NO：M 2014034。
【技术特征摘要】
1.一株产苹果酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌BA043（Escherichia coli BA043），其保藏登记号为CCTCC NO：M 2014034。
2.根据权利要求1所述的大肠埃希氏菌BA043的构建方法，其特征在于以缺失乳酸脱氢酶基因（ldhA）、丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）的菌株 NZN111为出发菌株，利用同源重组技术进一步敲除富马酸酶基因（fumB）和富马酸还原酶基因（frdABCD）活性，并共表达外源丙酮酸羧化酶基因（pyc）和烟酸磷酸核糖转移酶基因（pncB），得到产苹果酸的大肠埃希氏菌BA043。
3.如权利要求2所述的构建方法，其具体构建步骤如下：
步骤一，以缺失乳酸脱氢酶基因（ldhA）和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)活性的大肠杆菌菌株NZN111为出发菌株，敲除其中的富马酸酶基因（fumB）和富马酸还原酶基因（frdABCD），得到同时缺乏ldhA、pflB、fumB和frdABCD活性的感受态菌株；
步骤二，纯化扩增出丙酮酸羧化酶基因（pyc），构...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜岷，任心怡，马江锋，张敏，朱婧，李凤，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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