本发明专利技术公开了一株表达山羊α干扰素的重组腺病毒及其构建方法和应用。本发明专利技术首先提供了优化的山羊α干扰素基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示；本发明专利技术还提供一株稳定表达山羊α干扰素的重组腺病毒，其微生物保藏编号为：CGMCC No.8757。本发明专利技术进一步提供一种构建所述重组腺病毒的方法。本发明专利技术所构建的重组腺病毒能够稳定表达山羊α干扰素，病毒滴度高，抗病毒活性强；本发明专利技术重组腺病毒及其表达的山羊α干扰素在猪源细胞IBRS2、牛源细胞MDBK和原代羊皮肤细胞均具有抗病毒活性，能用于预防或治疗反刍动物病毒性传染病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及优化的山羊α干扰素基因，本专利技术还涉及一株稳定表达山羊α干扰素的重组腺病毒及其构建方法，本专利技术进一步涉及该优化的山羊α干扰素基因以及重组腺病毒在制备预防或治疗牛羊等反刍动物病毒性传染病药物中的应用，属于表达山羊α干扰素的重组腺病毒的构建及应用领域。
技术介绍
由病毒引起的动物传染性疾病严重制约了各个国家和地区养殖业的健康发展，同时也对人类健康构成严重的威胁。中国羊产业的规模巨大，是畜牧业的支柱性产业。对养羊业的最大威胁是病毒性传染病，例如羊痘、蓝舌病和羊传染性脓疱等。小反刍兽疫是养羊业的头号威胁，2007年从西藏阿里地区传入中国内地，虽然及时控制没有蔓延，但中国羊产业正面临严重的威胁。烈性病毒病的紧急应对策略是使用α干扰素。因此，干扰素对于动物病毒性传染病特别是烈性病的防治具有重要的经济价值。 干扰素（Interferon，IFN）是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子，主要是由动物细胞在病毒等诱生剂的作用下诱导产生的。许多动物，包括人、哺乳动物、鸟类等细胞均能产生干扰素。目前已知的干扰素分为三大类：I型、II型和III型。I型干扰素主要包括人体内发现的α、β、ω、ε和κ干扰素，以及在反刍动物中发现的τ以及小鼠中发现的ζ等几个亚类，其中IFN-α至少有17个亚群。Ⅱ型干扰素只有一种γ干扰素。最近发现的λ干扰素(IFN-λ)被认为是新的一类干扰素，国际最新分类标准里将它命名为Ⅲ型干扰素，共有3个亚群，分别为IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3。Ⅰ型干扰素是天然免疫的关键成员，是组成抗病毒感染的第一道防线。其中α干扰素在机体内发挥广谱、高效抗病毒作用的机制是抑制病毒蛋白质的合成，并能选择性地作用于受感染细胞，而对正常宿主细胞无作用或作用轻微。 随着人5型腺病毒载体应用研究的深入，其在基因免疫和治疗的研究中已显示明显的优势，当前国内外许多动物疫苗研究也应用人腺病毒表达系统，并且取得了预期的免疫效果。人腺病毒表达系统具有以下优点：宿主范围广，既可转染分裂细胞又可转染非分裂细胞；安全性可靠，缺损型腺病毒在宿主体内不能复制，而且不会整合到宿主细胞基因组；可以皮下、腹腔和肌肉等多种途径进行免疫，能够诱导体液免疫和细胞介导免疫；腺病毒的结构及特性研究的比较清楚，体外操作简便；重组腺病毒的性状稳定，冻干后可以长期保存，易于运输和产品的加工。 中国专利文献CN1970774A（申请号：200610124194.1）公开了一种猪α干扰素重组腺病毒及其构建方法，其构建方法步骤如下：猪α干扰素IFN-α基因的扩增、克隆；含有IFN-α基因的重组穿梭载体的构建；重组腺病毒质粒载体的构建；重组腺病毒的获得。该文献还公开了猪α干扰素重组腺病毒在制备抗病毒疫苗中的应用。但是，该方法获得的重组腺病毒滴度较低，而且带有GFP标签，不宜应用于临床。迄今未止，国内外尚无山羊α干扰素的表达及其生物功能研究的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供优化的山羊α干扰素基因； 本专利技术的目的之二是提供含有优化的山羊α干扰素基因的重组表达载体和含有该重组表达载体的宿主细胞； 本专利技术的目的之三是提供一种构建所述表达山羊α干扰素的重组腺病毒的方法； 本专利技术的目的之四是将所述优化的山羊α干扰素基因及表达该优化的山羊α干扰素的重组腺病毒应用于预防或治疗反刍动物病毒性传染病。 为了实现上述目的，本专利技术首先提供了优化的山羊α干扰素基因的核苷酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本专利技术根据哺乳动物细胞密码子偏嗜性对山羊α干扰素基因的密码子进行优化，并根据基因GC含量、二级结构等方面进行一系列手工优化得到了多条优化的山羊α干扰素基因；其中，SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在哺乳动物细胞中的表达效率以及稳定性远远优于其它的优化的山羊α干扰素基因。 本专利技术进一步提供了含有优化的山羊α干扰素基因的重组表达载体及含有该重组表达载体的宿主细胞。将优化的山羊α干扰素基因与表达载体进行可操作的连接，即得到表达山羊α干扰素的重组表达载体。其中，所述的表达载体优选为腺病毒载体，更优选为人5型腺病毒载体。 可以采用任何转化方法将本专利技术所构建的重组表达载体导入到目标细胞中，得到转化体；所述的转化方法包括：电转化法、脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法等；所述的目标细胞包括：腺病毒、哺乳动物细胞或大肠杆菌细胞等。 本专利技术将SEQ ID NO.1所示的优化的山羊α干扰素基因导入到腺病毒中，经筛选和鉴定获得3个重组腺病毒质粒，即：pAd-GoIFN-α-1、pAd-GoIFN-α-2和pAd-GoIFN-α-3；进一步的，本专利技术将3个重组腺病毒质粒分别转染HEK293细胞，观察细胞病变情况。结果表明，3个重组腺病毒质粒pAd-GoIFN-α-1、pAd-GoIFN-α-2、pAd-GoIFN-α-3分别转染HEK293细胞后7天，细胞开始出现病变，细胞变圆、变大、脱落，本专利技术通过筛选获得三株重组腺病毒，分别命名为rAd-GoIFN-α-1、rAd-GoIFN-α-2和rAd-GoIFN-α-3。本专利技术将收获的重组腺病毒进行传代，分别传至第5代时，细胞于接种病毒rAd-GoIFN-α-1、rAd-GoIFN-α-2、rAd-GoIFN-α-3后48h完全出现CPE，其中rAd-GoIFN-α-1的CPE出现最早，而且细胞病变明显。 针对重组腺病毒所表达的GoIFN-α蛋白的鼠阳性血清进行IFA检测，结果显示三株重组腺病毒感染的细胞均出现特异的荧光；其中，rAd-GoIFN-α-1接种细胞出现的荧光强度和数量明显优于rAd-GoIFN-α-2和rAd-GoIFN-α-3，而对照组则检测不到荧光；将三株重组腺病毒连续传10代，测定第8代病毒滴度，结果显示rAd-GoIFN-α-1病毒滴度为108TCID50/mL，而rAd-GoIFN-α-2和rAd-GoIFN-α-3的病毒滴度分别为106.5TCID50/mL和106.2TCID50/mL，结果表明三株重组腺病毒均能表达GoIFN-α，但是重组腺病毒rAd-GoIFN-α-1的病毒滴度显著高于其它两株重组腺病毒的滴度，而且重组腺病毒rAd-GoIFN-α-1表达GoIFN本文档来自技高网...
【技术保护点】
优化的山羊α干扰素基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.优化的山羊α干扰素基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID
NO.1所示。
2.含有权利要求1所述的优化的山羊α干扰素基因的重组表达载体。
3.含有权利要求2所述的重组表达载体的宿主细胞。
4.表达权利要求1所述的优化的山羊α干扰素基因的重组腺病毒。
5.按照权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，其微生物保藏
号是：CGMCC No.8757。
6.一种构建权利要求4或5所述的重组腺病毒的方法，其特征在于，
包括以下步骤：将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列与腺病毒穿梭载体可
操作的连接，得到重组腺病毒穿梭载体；将重组腺病毒穿梭载体线性化后
转化至含有...
【专利技术属性】
技术研发人员：于力，王芳，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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