一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法技术

本发明专利技术公开了一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法，其包含步骤：（1）用C1～C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液0.5～3h后，固液分离；（2）去除液体部分中的醇或酮后，过大孔吸附树脂，以甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液减压浓缩，得浓缩液；（3）将浓缩液通过聚苯乙烯反相色谱柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液洗脱，HPLC跟踪检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液，并减压浓缩得浓缩液；（4）将步骤（3）所得的浓缩液上样于聚苯乙烯反相色谱柱，用纯水冲洗脱盐，然后以纯甲醇洗脱，所得洗脱液即为含有WF11899A的洗脱液。本发明专利技术方法对WF11899A的提取纯度较高，收率高，纯化工艺简单，为从发酵液中分离纯化WF11899A提供了一种高效率低成本的工业化方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法，其包含步骤：（1）用C1～C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液0.5～3h后，固液分离；（2）去除液体部分中的醇或酮后，过大孔吸附树脂，以甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液减压浓缩，得浓缩液；（3）将浓缩液通过聚苯乙烯反相色谱柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液洗脱，HPLC跟踪检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液，并减压浓缩得浓缩液；（4）将步骤（3）所得的浓缩液上样于聚苯乙烯反相色谱柱，用纯水冲洗脱盐，然后以纯甲醇洗脱，所得洗脱液即为含有WF11899A的洗脱液。本专利技术方法对WF11899A的提取纯度较高，收率高，纯化工艺简单，为从发酵液中分离纯化WF11899A提供了一种高效率低成本的工业化方法。【专利说明】—种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法。
技术介绍
WF11899A (FR901379)最初是从腔胞纲菌 Coleophoma sp.F-11899 的发酵培养液中分离得到的一种脂肽类活性化合物，其分子式为C51H82N8O21S,经过结构修饰改造可得到一种抗真菌抗生素米卡芬净(Micafungin, MFG, FK463)。但是近年来,在其他近缘种中也逐渐发现一些菌株可以合成WF11899A及其结构类似物。米卡芬净是日本藤泽公司开发的一类新型水溶性棘白菌素类抗真菌抗生素，具有良好的医用市场前景。其作用机制为通过非竞争性抑制β-α，3)-葡聚糖合成酶的活性来抑制真菌细胞壁合成，且对人体正常细胞影响不大。临床实验表明其对由念珠菌属、曲霉菌属引起的深度真菌感染有广谱抗菌作用，对耐氟康唑、依曲康唑的念珠菌亦有作用。目前关于WF11899A的纯化方法主要是硅胶柱层析和离心分配色谱。文献“WF11899A，B and C，novel antifungal lipopeptides.1.Taxonomy, fermentation, isolation and physico-chemical properties，，(((the Journal ofAntibiotics)), 1994, 47 (10):1084-1091)和欧洲专利 EP0431350A1 中都公布了一种从 Coleophoma sp.F-11899 发酵液中分离纯化WF11899A的方法:发酵液用等体积的丙酮浸泡2h，过滤后去除丙酮。乙酸乙酯洗涤2次，活性物质萃取至正丁醇相，处理后上样于Si 60硅胶柱，利用CH2C12-甲醇混合液洗脱。浓缩后溶解在50% (体积百分比，下同)甲醇水溶液中，过ODS反相柱，用80%甲醇水溶液洗脱，再利用离心分配色谱进一步纯化。包含WF11899A的目标组分液富集后，再上样于硅胶柱、ODS反相柱，得到WF11899A洗脱液。干燥富集后溶于水，调pH至7.0，冷冻干燥后制得白色粉末WF11899A。但是这种方法存在以下缺点:1)分离纯化步骤较多，操作复杂；·2)吸附过程中存在不可逆吸附，收率较低。因此，现有技术中关于WF11899A的分离纯化方法均不利于在工业生产上推广应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的上述缺陷而提供一种高效率、低成本的从含WF11899A的发酵液中分离纯化WF11899A的方法。本专利技术提供的技术方案之一是:一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法，其包括如下步骤:(I)用Cl~C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液0.5~3h后，将发酵液进行固液分离，取液体部分；所述的Cl~C4的醇或酮与含WF11899A的发酵液的体积比为1:2 ~3: I ；(2)去除步骤(1)得到的液体部分中的Cl~C4的醇或酮后，过大孔吸附树脂，以甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，并减压浓缩，得浓缩液；(3)将步骤(2)所得的浓缩液通过聚苯乙烯反相色谱柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液洗脱，对洗脱过程进行HPLC跟踪检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液，并减压浓缩，得浓缩液；在所述的乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液中，乙腈的体积百分比为40%~60%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.4%~0.6% ；(4)将步骤(3)所得的浓缩液上样于聚苯乙烯反相色谱柱，用纯水冲洗脱盐，然后以纯甲醇洗脱，所得洗脱液即为含有WF11899A的洗脱液。本专利技术中，步骤(1)所述的含WFl 1899A的发酵液可以是任何已知的含有WFl 1899A的菌体发酵液，优选Coleophoma sp.F-11899发酵液。所述的Coleophoma sp.F-11899发酵液可以通过现有技术中常规的培养Coleophoma sp.F-11899的培养基培养获得，较佳地如欧洲专利EP0431350A1中公开的培养基配方，具体包括:斜面、平板培养基配方为(g/L):玉米粉17、KH2PO4 0.3、MgSO4.7H20 0.3、琼脂20、pH 6.5 ;种子培养基配方为(g/L):蔗糖40、棉籽蛋白粉20、干酵母粉10、蛋白胨10、KH2PO4 2、CaCO3 2、pH自然，另加入1%。(v/v)的Tween-80 ;发酵培养基配方为(g/L):可溶性淀粉60、葡萄糖10、小麦胚芽粉10、棉籽蛋白粉 5, KH2PO4 20, Na2HPO4.2H20 15, MgSO4.7H20 0.5、ZnSO4.7H20 UpH 自然。步骤(1)所述的固液分离的方法可以是已知的任何可以使菌体发酵液实现固液分离的方法，如离心分离法、过滤法、静置沉淀法等，本专利技术优选离心分离法；所述离心分离法为本领域常规的离心操作；较佳地，所述离心分离法的条件为以2000~6000r/min离心10~40min ;更佳地,所述离心分离法的条件为以4000r/min离心20min。所述Cl~C4的醇或酮可以是本领域常规，较佳地选自甲醇、乙醇、丙酮和正丁醇中的任一种，优选丙酮。所述用Cl~C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液的时间较佳地为1.5~3h，更佳地为2h。本专利技术步骤(2)中，所述的大孔吸附树脂可以为非极性、弱极性或中等极性大孔吸附树脂，优选X-5、XAD-2、XAD-7和ADS-17中的任一种。所述的甲醇水溶液中甲醇的体积百分比较佳地为60%~100%，更佳的为85~95%。所述的去除步骤(1)得到的液体部分中的Cl~C4的醇或酮的方式可以是本领域常规的方式，优选减压去除。本专利技术步骤(3)中，所述的聚苯乙烯反相色谱柱可以是本领域常规的聚苯乙烯反相色谱柱，优选PS25-300或NMPS-100。在所述的乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液中，乙腈的体积百分比优选40~45%，磷酸二氢铵的质量百分比优选0.5%。本专利技术步骤(4)中，所述的HPLC的检测条件为本领域常规的HPLC检测条件，较佳地为=Agilent XDB-C18柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液(其中，乙腈的体积百分比为45%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%)为流动相，流速为1.0ml/min,进样量20 μ 1，柱温30°C，检测波长212nm。在所述脱盐的处理过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法，其特征在于，其包括如下步骤：（1）用C1～C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液0.5～3h后，将发酵液进行固液分离，取液体部分；所述的C1～C4的醇或酮与含WF11899A的发酵液的体积比为1︰2～3︰1；（2）去除步骤（1）得到的液体部分中的C1～C4的醇或酮后，过大孔吸附树脂，以甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，并减压浓缩，得浓缩液；（3）将步骤（2）所得的浓缩液通过聚苯乙烯反相色谱柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液洗脱，对洗脱过程进行HPLC跟踪检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液，并减压浓缩，得浓缩液；在所述的乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液中，乙腈的体积百分比为40%～60%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.4%～0.6%；（4）将步骤（3）所得的浓缩液上样于聚苯乙烯反相色谱柱，用纯水冲洗脱盐，然后以纯甲醇洗脱，所得洗脱液即为含有WF11899A的洗脱液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：芦现杰，胡海峰，朱宝泉，张长清，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海;31