特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体制造技术

特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学技术领域。本发明专利技术提供了利用全细菌SELEX技术（whole bacteria‑SELEX）筛选粪肠球菌适配体的方法，得到35条粪肠球菌特异性适配体序列，并从中优选出Apt10、Apt21、Apt29、Apt34四条与粪肠球菌具有高亲和力的ssDNA适配体序列，可以特异性地和粪肠球菌结合，为粪肠球菌的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰的高特异性检测识别元件。

【技术实现步骤摘要】
特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体
本专利技术涉及特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，具体涉及对粪肠球菌特异性的新型识别元件ssDNA适配体的筛选，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学

技术介绍
肠球菌（Enterococcus）是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌，检出率仅次于大肠杆菌，其致病机理主要是通过分泌细胞溶解素、明胶酶等毒性物质侵袭破坏宿主组织细胞，并耐受宿主的非特异性免疫应答，从而引起感染性疾病的发生与发展。随着抗生素的广泛使用，肠球菌的多重耐药性不断增强，特别是耐万古霉素的肠球菌的出现，使肠球菌感染成为重要的公共卫生问题。据2010年中国CHINET细菌耐药监测网显示，肠球菌在尿路感染中所占比例仅次于大肠埃希菌，而在血流感染中居第三位。临床感染的肠球菌以粪肠球菌和屎肠球菌为主，其中粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）最为多见，约45%~65%。目前，常规的粪肠球菌检测方法主要分为四大类，即微生物学检测法、分子生物学方法、免疫学方法和仪器分析法。然而，这些方法存在灵敏度低、成本高、耗时长、操作繁琐等缺点，不能很好地实现粪肠球菌的快速检测。因此，建立一种高灵敏度、快速检测粪肠球菌的方法是十分必要的。指数富集的配体系统进化技术（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX）是近年来新建立的一种体外筛选技术，基于单链寡核苷酸碱基之间可以形成多种空间结构，这些结构容易与靶分子结合的原理，从含有1013~1015个不同基元的初始文库中，经过数十轮的重复筛选富集过程，获得高亲和性、高特异性的核酸适配体。SELEX可以应用于各种类型靶分子的筛选上，不仅可以筛选无机或有机小分子、蛋白质、糖、抗生素等单个靶分子，还可以筛选复杂的靶结构或组成不明确的复合靶如靶分子混合物、生物体、完整细胞等。利用SELEX技术筛选获得的适配体有着比抗体分子更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗不能区分的抗原物质。同时，与蛋白质性质的抗体相比，核酸适配体具有明显的优越性，例如：靶分子范围广，不受免疫条件和免疫原性的限制，可在体外人工合成并且合成技术已非常成熟，变性与复性可逆，可应用于非生理条件下，可根据需求进行多种化学修饰，易于长期室温保存等。这些特性使得适配体在生物医药研究领域得到广泛应用。近年来已有学者将适配体应用于抗生素的检测领域，同生物传感器平台结合，发展出快速、新颖的检测方法而备受关注。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过wholebacteria-SELEX技术，筛选得到能特异性识别和结合粪肠球菌的ssDNA适配体，该适配体是粪肠球菌的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势。本专利技术的技术方案，特异性结合粪肠球菌的ssDNA适配体，选自序列表Apt1~Apt35所示序列的一种或多种，包括含有Apt1~Apt35所述序列的ssDNA。其中，序列表Apt1~Apt35在结构上均符合下述通式所示的结构特征：5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N35-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’。其中N代表碱基A、T、C、G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。在序列表中，优选序列Apt10、Apt21、Apt29和Apt34所示的序列。具体如下：Apt10:5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCAAGGTCACATAGTGCACTCTATGTGAGTACCCTTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’；Apt21:5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCTTGAAATCGCACAAGTTCCGTCCTCTCTACGACTCCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’；Apt29:5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGTCGTCCAAGCATTGCTCAAAAGGAACCGTAGTTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’；Apt34:5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGTTGCAGCGACAGCCCGGTTTTATGTTTGTAAGTGCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’。根据序列表Apt1~Apt35所述的适配体，其能被提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基等所修饰。用于粪肠球菌检测的组合物、试剂盒和芯片，其中含有序列表Apt1~Apt35中任一项的适配体。筛选特异性结合粪肠球菌ssDNA适配体的wholebacteria-SELEX技术是采用文库与菌株孵育结合后，热变性并离心的方法，结合PCR扩增技术，在链霉亲和素-生物素的作用下，以指数的方式富集与粪肠球菌特异性结合的寡核苷酸（图1），包括步骤（a）-（j）：a、筛选文库：5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N35-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’，其中N代表碱基A、T、C、G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基；引物：引物I-1：5’-TAGGGAATTCGTCGACGGAT-3’；引物I-2：5’-FAM-TAGGGAATTCGTCGACGGAT-3’；引物II-1：5’-CGGCGCATGCGTCGACCTG-3’；引物II-2：5’-biotin-CGGCGCATGCGTCGACCTG-3’。b、粪肠球菌溶液：1×108cfu/mL；c、链霉亲和素磁珠：粒径1-2µm，浓度为5mg·mL-1；d、使步骤a中的ssDNA文库与步骤b中的粪肠球菌溶液在适宜的条件下孵育；所述适宜条件包括37℃，作用时间45min，结合缓冲液（BB）成分为50mmol·L-1Tris-HCl（pH7.4），5mmol·L-1KCl，100mmol·L-1NaCl，1mmol·L-1MgCl2·H2O；e、通过热变性、离心收集经步骤d处理的与步骤b中粪肠球菌结合的ssDNA序列；f、采用引物I-1和引物II-2对步骤e的文库成员进行PCR扩增；g、链霉亲和素磁珠法制备ssDNA次级文库：步骤c中的链霉亲和素磁珠经PBS（94.7mmol·L-1Na2HPO4·12H2O，5.3mmol·L-1NaH2PO4·2H2O，1.54mmol·L-1NaCl，pH8.0）洗涤后加入步骤f中所得的生物素标记的PCR产物，室温结合2h（轻微震荡），磁性分离弃上清、经PBS缓冲液冲洗，洗去未结合到磁珠上的dsDNA。向上述混合物中加入NaOH溶液，37℃孵育2h，磁性分离，将带生物素的一条链留在链霉亲和素磁珠上，洗下不带生物素的一条单链DNA，即为下一轮筛选的次级文库；h、收集步骤e或步骤g中与步骤b特异性结合的文库成员；i、重复步骤d～g，重复次数1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12次，优选重复12次；j、对步骤h获得的最终文库成员进行确定，优选序列测定。本专利技术的有益效果：本专利技术采用wholebacteria-SELEX技术，筛选得到与粪肠球菌高特异结合的ssDNA适配体，方法快速简便易操作，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，其特征在于其在结构上均符合下述通式所示的结构特征：5’‑TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC‑N35‑CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG‑3’；其中N代表碱基A、T、C、G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。

【技术特征摘要】
1.特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，其特征在于其在结构上均符合下述通式所示的结构特征：5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N35-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’；其中N代表碱基A、T、C、G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。2.根据权利要求1所述特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，其特征在于：其包括序列表所述序列Apt1~Apt35中的一种或多种，包括含有Apt1~Apt35所述序列的ssDNA。3.根据权利要求2所述特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，其特征在于：包括含有Apt10、Apt21、Apt29、Apt34所示序列的ssDNA：Apt10:5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCAAGGTCACATAGTGCACTCTATGTGAGTACCCTTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’；Apt21:5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCTTGAAATCGCACAAGTTCCGTCCTCTCTACGACTCCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’；Apt29:5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGTCGTCCAAGCATTGCTCAAAAGGAACCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：周楠迪，巫朦朦，田亚平，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32