基于适配体的分析物测定法制造技术

本发明专利技术涉及包含一级和二级适配体的捕获和/或检测分析物的基于适配体的测定法，以及包含此类一级和二级适配体的组合物，其中分析物包含小分子，其为抗体提供有限的相互非竞争性表位，换言之，在使用一级和二级抗体或一级和二级适配体的非竞争性夹心测定中测量的能力有限。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于适配体的分析物测定法优先权要求本专利申请要求均在2016年6月3日提交的美国临时申请62/345,641和62/345,697以及在2016年6月6日提交的美国临时申请号62/346,374的优先权，所述申请各自的内容均在此以其整体通过引用并入本文。拨款信息本专利技术在由国立卫生研究院授予的拨款号RGM104960和由国家科学基金会授予的拨款号CCF1518715下的政府支持下进行。政府在本专利技术中具有某些权利。1.引言本专利技术涉及基于适配体的测定以捕获和/或检测分析物，包括向抗体提供有限的相互非竞争性表位的小分子，且因此难以使用传统的抗体夹心型测定法检测或测量。2.专利技术背景非竞争性夹心测定采用两种不同的结合元件来捕获然后检测分析物1-5。例如，夹心测定形式的典型实例是平板上的酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中针对靶分析物(例如，蛋白质)的一种抗体(捕获抗体)与固体支持物(例如，板)结合，分析物被结合，然后引入携带可检测部分的第二抗体(“检测抗体”)，其与捕获的分析物上的不同位点结合。因为在分析物上通常存在替代结合位点，所以在过量试剂存在的情况下，这些测定可以比竞争性测定更灵敏，检测具有渐增信号的配体，并且具有更低的噪音。夹心原理还允许更严格的洗涤方案，其使非特异性相互作用最小化。与靶分析物相互作用的两种或更多种结合元件的原理(即，“夹心化”)也用于除了ELISA以外的其他测定，诸如侧向流测定或胶乳-珠粒凝集测定。夹心方法对于小的分析物变得有问题，所述小分析物可能太小而不能一次与两个抗体结合(例如，类固醇或儿茶酚胺或甚至一些小肽诸如血管加压素)或者是非免疫原性(例如，分子诸如苯丙氨酸或葡萄糖)。当可以获得针对小分子的抗体时，几种特殊方法6-9已经产生针对小分子的ELISA样测定。适配体是基于寡核苷酸的受体，其可以与小分子结合9-15。适配体先前已经用于传统的夹心测定中，然而，传统的夹心测定取决于分析物中多于一个结合位点的可用性。因此，需要用于检测小分子的方法，其克服由于缺乏多个表位而引起的问题。3.专利技术概述本专利技术涉及基于适配体的测定法，所述方法用于捕获和检测可能不适于基于抗体的测定法的分析物。提供了三种不同的示例性测定法，以及各种包含核心序列和操作序列的适配体，其中所述操作序列可以根据待使用的测定法而不同。第一组实施方案提供了“抗适配体测定法”，其中使待测试目标分析物的存在和/或量的样品与有效量的以下物质接触：(1)包含与分析物结合的核心序列的一级适配体，和(2)与一级适配体的至少一部分互补的“抗适配体”，其中所述一级适配体和/或抗适配体包含可检测部分，所述可检测部分检测所述一级适配体和抗适配体是否与彼此结合；且其中与所述分析物结合的一级适配体不结合抗适配体。所述分析物与抗适配体竞争结合一级适配体，使得结合(或未结合的)抗适配体的量与存在的分析物的量相关。第二组实施方案提供了“假夹心测定法”，其中使待测试目标分析物的存在和/或量的样品与有效量的以下物质接触：(1)一级适配体，其包含与分析物结合的核心序列以及与结构转换“传感器寡核苷酸”互补的至少一部分；(2)传感器寡核苷酸，其任选地与固体支持物结合，其任选地进一步包含与“comp”(代表“互补”)寡核苷酸互补的部分；其中所述一级适配体和/或传感器寡核苷酸和/或comp寡核苷酸包含可检测部分，所述可检测部分可以检测所述一级适配体和传感器寡核苷酸是否与彼此结合；且其中所述一级适配体和传感器寡核苷酸形成部分双链螺旋，当所述一级适配体与分析物结合时，所述部分双链螺旋可检测地解离或不形成。例如，可以将测试样品添加至有效量的由一级适配体和传感器寡核苷酸和comp寡核苷酸构成的复合物中；从所述复合物释放的一级适配体的量与所述测试样品中的分析物的量相关(并且所述comp和所述传感器寡核苷酸形成至少部分双链结构)。作为一个进一步实例，且不通过限制的方式，可以将所述复合物连接至固体支持物，应用测试样品，然后可以检测释放的一级适配体。作为一个更具体非限制性实例，所述传感器寡核苷酸可以与固体支持物连接并与一级适配体复合，然后可以使所得复合物与测试样品接触，且检测释放的一级适配体的量，例如，洗掉支持物。第三组实施方案提供了“夹心测定法”，其中使待测试目标分析物的存在和/或量的样品与有效量的以下物质接触：(1)一级适配体，其包含与分析物结合的核心序列以及当其与分析物结合时结合二级适配体的至少一部分；和(ii)夹心适配体(在本文中也称为“二级适配体”)，其结合一级适配体，条件是所述一级适配体与分析物结合以形成三元复合物(“夹心”)；其中所述一级适配体和/或夹心适配体包含可检测部分，所述可检测部分可以检测所述一级适配体和夹心寡核苷酸是否与彼此结合。例如，可以将测试样品添加至有效量的一级适配体和夹心适配体中，然后可以检测一级适配体/夹心适配体复合物的量，或未结合的一级适配体或夹心适配体的量。本文还提供了共有核心序列、核心序列和一级适配体，其可以结合目标一级适配体，包括葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵离子、硼酸、肾上腺素、肌酸酐和血管加压素。进一步提供了相关的抗适配体、传感器、comp和夹心适配体/寡核苷酸。进一步实施方案提供了包含前述一级适配体和/或寡核苷酸的试剂盒。4.附图简述图1A-G.一级适配体(短形式)和相应的靶分析物的结构。(A)一级适配体(SEQIDNO:62，SEQIDNO:12的子序列)及其靶分析物，脱氧皮质酮21-葡糖苷(“DOG”)；(B)一级适配体(SEQIDNO:63)及其靶分析物，醛固酮(“ALDS”)；(C)一级适配体(SEQIDNO:64，SEQIDNO:5的子序列)及其靶分析物，可的松(“CS”)；(D)一级适配体(SEQIDNO:65，SEQIDNO:13的子序列)及其靶分析物，睾酮(“TES”)；(E)一级适配体(SEQIDNO:66)及其靶分析物，Phe-CpRh；(F)一级适配体(SEQIDNO:67)及其靶分析物，L-苯丙氨酸；(G)一级适配体(SEQIDNO:68，SEQIDNO:1的子序列)及其靶分析物，葡萄糖。图2A-C.“抗适配体测定”的设计原理。(A)有效量的用荧光标记物(例如，F＝荧光素)标记的一级适配体(”适配体“)及其用猝灭剂(例如，D＝dabcyl猝灭剂)标记的“互补”寡核苷酸(也称为“抗适配体”)可以杂交以形成双链体。在双链体形成后，适配体上的标记物的荧光被猝灭。(B)在靶分析物存在的情况下，一级适配体与分析物、而不是其互补抗适配体结合，并且其标记物的荧光不被猝灭。(C)显示荧光随着未加热样品、但不是加热样品中的靶分析物DOG浓度增加而增加(因为加热干扰分析物/适配体结合)。图3A-L.使用“短形式”一级适配体的各种靶分析物的抗适配体测定的结果的实例。(A)与荧光标记物(例如，F＝荧光素)连接的针对脱氧皮质酮21-葡糖苷(“DOG”)的一级适配体(SEQIDNO:62)及其用猝灭剂(例如D＝dabcyl猝灭剂)标记的互补抗适配体(SEQIDNO:69)可以杂交以形成双链体(由SEQIDNO:本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于测试样品中目标分析物的存在和/或量的测定法，其包括使所述样品的至少一部分与有效量的以下物质接触：(1)包含与分析物结合的核心序列的一级适配体，和(2)与一级适配体的至少一部分互补的抗适配体，其中所述一级适配体和/或抗适配体包含可检测部分，所述可检测部分检测所述一级适配体和抗适配体是否与彼此结合；且其中与所述分析物结合的一级适配体不结合其抗适配体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.03 US 62/345,641;2016.06.03 US 62/345,697;1.用于测试样品中目标分析物的存在和/或量的测定法，其包括使所述样品的至少一部分与有效量的以下物质接触：(1)包含与分析物结合的核心序列的一级适配体，和(2)与一级适配体的至少一部分互补的抗适配体，其中所述一级适配体和/或抗适配体包含可检测部分，所述可检测部分检测所述一级适配体和抗适配体是否与彼此结合；且其中与所述分析物结合的一级适配体不结合其抗适配体。2.权利要求1的测定法，其中所述一级适配体包含荧光标记物。3.权利要求1或2的测定法，其中所述抗适配体包含猝灭剂部分。4.权利要求1、2或3的测定法，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少85％互补。5.权利要求4的测定法，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少95％互补。6.权利要求1-5中任一项的测定法，其中所述分析物选自葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵、硼酸和肾上腺素。7.检测或测量样品中目标分析物的存在或量的方法，其包括(i)在如果不存在靶分析物则允许一级适配体和抗适配体之间形成双链体的条件下使样品的至少一部分与有效量的一级适配体和与一级适配体的至少一部分互补的抗适配体接触，所述一级适配体和/或抗适配体包含允许检测和/或测量与分析物结合的一级适配体的量；和(ii)检测和任选地定量未与抗适配体结合的一级适配体的量。8.权利要求7的方法，其中所述一级适配体包含荧光标记物。9.权利要求7或8的方法，其中所述抗适配体包含猝灭剂部分。10.权利要求7、8或9的方法，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少85％互补。11.权利要求10的方法，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少95％互补。12.权利要求7-11中任一项的方法，其中所述分析物选自葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵、硼酸、肾上腺素、肌酸酐和血管加压素。13.检测或测量样品中目标分析物的存在或量的方法，其包括(i)在如果不存在分析物则允许一级适配体和抗适配体之间形成双链体的条件下使样品的至少一部分与有效量的以下物质接触：(a)包含荧光标记物的一级适配体和(b)抗适配体，其包含如果一级适配体和抗适配体在双链体中结合在一起则猝灭所述荧光标记物的荧光的部分；和(ii)检测和任选地定量荧光的量。14.权利要求13的方法，其中所述一级适配体包含荧光标记物。15.权利要求13或14的方法，其中所述抗适配体包含猝灭剂部分。16.权利要求13、14或15的方法，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少85％互补。17.权利要求16的方法，其中所述抗适配体与所述一级适配体的至少95％互补。18.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述分析物选自葡萄糖、氢化可的松、苯丙氨酸、脱氢异雄甾酮、脱氧可的松、睾酮、醛固酮、多巴胺、鞘氨醇-1-磷酸、血清素、褪黑激素、酪氨酸、妥布霉素、阿米卡星、亚甲基蓝、铵、硼酸、肾上腺素、肌酸酐和血管加压素。19.试剂盒，其包含与目标分析物结合的一级适配体和与一级适配体的至少一部分互补的抗适配体。20.权利要求19的试剂盒，其中所述一级适配体包含荧光标记物。21.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·斯托亚诺维克，K·杨，S·泰勒，N·米洛索维奇，
申请(专利权)人：纽约市哥伦比亚大学理事会，
类型：发明
国别省市：美国,US