本发明专利技术涉及一种邻苯二甲酸酯类增塑剂DNA核酸适配体及其筛选与表征方法及电化学传感器。本发明专利技术的方法包括如下步骤：步骤一：通过化学合成制备在其中一条线性脂肪侧链的末端具有氨基基团的邻苯二甲酸二丁酯的衍生物；步骤二：通过氨基与琼脂糖微球上的环氧乙烷活化基团进行缩合反应将DBP‑NH2共价连接到琼脂糖微球上；步骤三：进行基于固相分离的核酸适配体筛选；步骤四：筛选后对获得的富集文库进行高通量测序；步骤五：对高通量测序中出现频率最高的两条序列DBP‑1和DBP‑2进行亲和力和选择性的测试；步骤六：构建基于DBP‑1的电化学传感器。本发明专利技术可以用于开发各种各样的检测技术和生物传感器，为食品或环境中的邻苯二甲酸酯类增塑剂的便捷检测有着重要应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种邻苯二甲酸酯类增塑剂单链DNA核酸适配体及其筛选与表征方法及电化学传感器本申请为申请日为2016年10月26日、申请号为201610949635.5和名称为“一种邻苯二甲酸酯类增塑剂单链DNA核酸适配体及其筛选与表征方法及应用其的电化学传感器”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及一种邻苯二甲酸酯类增塑剂单链DNA核酸适配体及其筛选与表征方法及应用其的电化学传感器，属于生物
技术介绍
邻苯二甲酸酯类物质(PhthalateEsters或PhthalicAcidEsters,PAEs)是邻苯二甲酸形成的酯的统称，其化学结构是由一个平面芳烃和两个脂肪侧链组成。PAEs主要用于聚氯乙烯材料，使聚氯乙烯由硬塑胶变为有弹性的塑胶，起到增塑的作用。PAEs被广泛应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品(如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液)等数百种产品中。PAEs是酯类化合物中较难降解的一类持久性有机污染物(persistentorganicpollutants，POPs)，也是公认的环境内分泌干扰物。PAEs是一类脂溶性物质，可通过呼吸、饮食和皮肤接触进入人体，对人体造成危害。研究表明PAEs在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，可干扰内分泌，使男子精液量和精子数量减少，精子运动能力低下，精子形态异常，严重的会导致睾丸癌，是造成男子生殖问题的“罪魁祸首”。它还会增加女性患乳腺癌的几率，还会危害到她们未来生育的男婴的生殖系统。目前被认为是有害物质的PAEs为15种，其中邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)6种已被欧盟列为总检出量必须低于1％的对人体和环境有害的物质。我国对生活饮用水、地表水和污水处理厂的污染物排放标准中都对多种PAEs有着明确限值。由于DBP潜在的内分泌干扰毒性最大，其限值均最低。比如我国生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)对DBP的限值低达0.003mg/L(～1nM,3ppb)。现阶段国内外对增塑剂的检测还仅限于大型仪器，比如高效液相和质谱，不能实现现场高效和及时的监测。如何快速、准确、直接有效地检测食品和水体中的增塑剂，是环境和食品安全等相关科研工作者热切期待能够解决的技术难题。核酸适配体是通过SELEX技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,即系统指数富集的适配体系统进化技术)获得的单链或双链的DNA或RNA(Nature,1990,346,818-822；Nature,1992,355,564-566)。核酸适配体能够特异性识别包括蛋白质、小分子、细胞和组织在内的多种多样的靶分子，其稳定性高，易于合成和修饰，成本低，在生物传感、成像和药物研发等领域都具有广泛的应用前景。目前，通过体外筛选技术获得的核酸适配体有很多，很多已经实现在线快速高灵敏检测，但是未见到特异性识别邻苯二甲酸酯类增塑剂核酸适配体的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种邻苯二甲酸酯类增塑剂单链DNA核酸适配体及其筛选与表征方法及应用其的电化学传感器。本专利技术是利用SELEX技术筛选出能够与DBP等邻苯二甲酸酯类增塑剂特异性和高亲和力结合的单链DNA核酸适配体序列，并利用该核酸适配体构建能够对DBP等邻苯二甲酸酯类增塑剂进行高灵敏和高特异性检测的电化学传感器。本专利技术提供的一种与邻苯二甲酸酯类增塑剂具有高特异性和高亲和力的单链DNA核酸适配体。该核酸适配体的单链DNA序列高度富集，来自同一富含C碱基家族:5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACN1-4TCCCACGCATTCTCCACAT3'和/或者为其单碱基或双碱基的变异体。其中高通量测序中出现频率最高的两条核酸适配体分别为：DBP-1：5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT3'，和DBP-2:5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACAGGTCCCACGCATTCTCCACAT3'。本专利技术提供的一种邻苯二甲酸酯类增塑剂单链DNA核酸适配体的筛选与表征及应用其的电化学传感器的方法，包括如下步骤：步骤一：通过化学合成制备在其中一条线性脂肪侧链的末端具有氨基基团的邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的衍生物(DBP-NH2)；步骤二：通过氨基与琼脂糖微球上的环氧乙烷活化基团进行缩合反应将DBP-NH2共价连接到琼脂糖微球上；步骤三：进行基于固相分离的DNA核酸适配体的SELEX筛选；步骤四：筛选后对获得的富集文库进行高通量测序；步骤五：对高通量测序中出现频率最高的两条序列DBP-1和DBP-2进行亲和力和选择性的测试；步骤六：构建基于DBP-1的电化学传感器。本专利技术还提供一种基于上述核酸适配体的电化学生物传感器，其信号探针为DBP-1-10T-C-Fc或者DBP-1-C-Fc。本专利技术通过化学合成制备了在其中一条线性脂肪侧链的末端具有氨基基团的邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的衍生物(DBP-NH2)。然后通过氨基与琼脂糖微球上的环氧乙烷活化基团进行缩合反应将DBP-NH2共价连接到琼脂糖微球上。随后进行基于固相分离的核酸适配体筛选。4轮筛选后对获得的富集文库进行高通量测序，发现出现频率最高的前100条DNA序列均来自同一家族。利用实时定量PCR技术对出现频率最高的2条核酸适配体(DBP-1和DBP-2)对DBP-NH2的亲和力进行测试，分别为70±5nM和100±5nM。DBP-1和DBP-2对DBP、DEHP、BBP的亲和力比对DBP-NH2的亲和力高1.5-4.0倍。DBP-1和DBP-2均对DBP、DEHP、BBP具有很好的专一性，对葡萄糖、卡那霉素和乙醇等小分子和重金属离子(Hg2+,Pb2+,Ni2+,Cd2+)没有显著的亲合力。基于该核酸适配体构建了DBP电化学传感器。该传感器对DBP具有很好的选择性和灵敏度。检出限达到10pM，动力学区间10pM-1mM。由于邻苯二甲酸酯类增塑剂的结构相似性，可以预计本专利技术的核酸适配体对其它邻苯二甲酸酯类增塑剂也应该具有高的亲和力和选择性。本专利技术具有如下特征和技术优势：(1)本专利技术获得的单链DNA核酸适配体序列，与DBP、BBP和DEHP均具有很高的亲和力(解离常数Kd分别在nM范围)，且具有很好的专一性。由于邻苯二甲酸酯类增塑剂的结构相似性，可以预计本专利技术的核酸适配体对其它邻苯二甲酸酯类增塑剂也应该具有高的亲和力和选择性。(2)本专利技术中靶分子固相固定方式是首先将DBP的疏水侧链进行化学修饰获得DBP-NH2，然后通过氨基和环氧基团之间的缩合反应将DBP-NH2共价连接到环氧乙烷活化的琼脂糖微球上，使得邻苯二甲酸二酯基团暴露在微球的表面，这样就可以实现对邻苯二甲酸酯类增塑剂共同官能团的筛选，而不是仅筛选一种特定的邻苯二甲酸酯类增塑剂。(3)(2)中所提及的靶分子固相固定方式还可以大幅减小界面的非特异性吸附和减少筛选轮数，本专利技术结合高通量测序技术，仅通过4轮筛选就获得了高度富集的核酸适配体。(4)本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种邻苯二甲酸酯类增塑剂单链DNA核酸适配体，其特征在于，该核酸适配体为与邻苯二甲酸酯类增塑剂具有高特异性和高亲和力的核酸适配体。
【技术特征摘要】
1.一种邻苯二甲酸酯类增塑剂单链DNA核酸适配体，其特征在于，该核酸适配体为与邻苯二甲酸酯类增塑剂具有高特异性和高亲和力的核酸适配体。2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，该核酸适配体的单链DNA序列高度富集，来自同一富含C碱基家族。3.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，该核酸适配体的单链DNA序列为5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACN1-4TCCCACGCATTCTCCACAT3'和/或者为其单碱基或双碱基的变异体。4.根据权利要求3所述的核酸适配体，其特征在于，该核酸适配体的单链DNA序列为DBP-1：5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT3'。5.根据权利要求3所述的核酸适配体，其特征在于，该核酸适配体的单链DNA序列为DBP-2:5'CTTTCTGTCCTTCCGTCACAGGTCCCACGCATTCTCCACAT3'。6.一种基于如权利要求1-5中任一权利要求所述的核酸适配体的电化学生物传感器。7.如权利要求6所述的电化学生物传感器，其信号探针为DBP-1-10T-C-Fc或者DBP-1-C-Fc。8.一种邻苯二甲酸酯类增塑剂单链DNA核酸适配体的筛选与表征的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤一：通过化学合成制备在其中一条线性脂肪侧链的末端具有氨基基团的邻苯二甲酸二丁酯的衍生物；步骤二：通过氨基与琼脂糖微球上的环氧乙烷活化基团进行缩合反应将其中一条线性脂肪侧链的末端具有氨基基团的邻苯二甲酸二丁酯的衍生物共价连接到琼脂糖微球上；步骤三：进行基于固相分离的核酸适配体筛选。9.根据权利要求8所述的的方法，其特征在于，步骤一如下：(1)邻苯二甲酸单丁酯的制备；DCC缩合产物的制备；其中一条线性脂肪侧链的末端具有氨基基团的邻苯二甲酸二丁酯的衍生物的制备。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，(1)邻苯二甲酸单丁酯的制备如下：将8.5g，57mmol邻苯二甲酸酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：娄新徽，何苗，韩宇，刁冬林，郭倩，
申请(专利权)人：首都师范大学，清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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