本发明专利技术公开一套基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体及应用，属于基因工程、免疫学和肿瘤学技术领域。所述的适配体为SEQ ID NO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。本发明专利技术核酸适配体利用全细胞消减Cell‑SELEX技术筛选而得，分子量较小，易于合成与修饰，能够高特异性识别并且高亲和力结合ATG16L1、CSNK2、PPP1等肿瘤标志物分子，与其它细胞不发生特性结合，无免疫原性，稳定易修饰，便于合成和保存。用所述适配体制备的肿瘤标志分子检测试剂盒和试剂纸对肿瘤标志分子检测灵敏度高，且易于优化。在肿瘤诊断、肿瘤预后与监测的评估，肿瘤诊断中应用。
【技术实现步骤摘要】
一套基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体及应用
本专利技术属于基因工程、免疫学和肿瘤学
，特别涉及一套基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体及应用。
技术介绍
从酵母菌到哺乳动物的研究中均证实自噬系统受到一些进化的自噬相关蛋白（ATG）的严格调控。自噬始于BECN1/Beclin1与III类磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3C3），它有助于吞噬泡吸收其他ATG蛋白形成细胞核。在扩增时，细胞质内容物被双膜吞噬泡直接吸收，然后生成完整的自噬体；自噬体与溶酶体融合降解其它物质。自噬体成熟需要一系列的泛素样共轭事件，主要涉及LC3-磷脂酰乙醇胺（PE）和ATG12-ATG5-ATG16L1共轭体系。这些核心ATG蛋白，包括ATG16L1，都是自噬体不可或缺的。ATG16L1与ATG12-ATG5交互共轭形成二聚体复合物，其靶向吞噬细胞并通过充当一种脂质E3类泛素连接酶促进MAP1LC3B/LC3B（微管相关蛋白质1轻链3b）酯化，虽然ATG16L1在自噬过程中的功能过程有据可查，但对ATG16L1活性的调控机制知之甚少。CSNK2是一个高度保守的，组成性的，广泛表达的丝氨酸-苏氨酸激酶，是一个包含2个催化亚基的四聚体全酶（CSNK2A1/a和/或CSNK2A2/a'）和2个监管亚基（CSNK2B/b）的复合物。该酶承担超过300个底物的磷酸化并影响一系列的生物过程，包括染色体分离，纺锤体形成，调节细胞凋亡，控制细胞增殖，和昼夜节律。最近的研究也表明aPPP1在自噬调控中发挥潜在的作用。蛋白磷酸化可以被磷酸酶等逆转，例如PPP1，一种普遍表达的真核丝氨酸/苏氨酸，是能影响多种细胞功能和过程的蛋白磷酸酶。PPP1归属的蛋白磷酸酶家族包括4个主要亚科：PPP1，PPP2CA，PPP2CB和PPP5。有趣的是，像CSNK2一样，PPP2（蛋白磷酸酶2）促进亲自噬BECN1活性通过诱导构象变化BECN1在Ras-NIH3T3细胞中。核酸适配体是一类能与靶分子高特异性高亲和力结合的DNA或RNA序列，具有与抗体类似的作用，常常被称为“化学抗体”。近年来，随着核酸适配体筛选技术的不断发展，越来越多的肿瘤相关核酸适配体序列被人们所发现。然而，这些肿瘤相关的核酸适配体常常仅能识别一种肿瘤细胞或一种肿瘤，很大程度限制了核酸适配体的应用。CRISPR/Cas9技术作为近几年的热门技术，是众多学者研究和应用的对象，CRISPR/Cas9技术对靶细胞目的基因进行靶向敲除（Knockout）或敲入（Knockin）多是用于基因治疗，运用此方式构建细胞模型进行进一步生物学研究还有待开发。目前，Cell-SELEX进行核酸适配体筛选多是针对不同种类的未知靶点的肿瘤细胞进行。但不同肿瘤细胞之间具有差异性，缺乏共同的靶标分子。因此，利用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达目的基因的稳转细胞系，减少细胞模型的构建时间，降低模型的构建成本，是本领域技术人员亟待解决的难题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种分子量较小，易于合成与修饰，提出一套基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体及应用。为实现本专利技术目的，使用的技术方案为：一套基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体，所述的适配体为SEQIDNO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。优选的，所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列的同源性为60%以上的序列。优选的，所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行杂交的序列。优选的，所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行转录的序列。优选的，所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行优化截短的序列。优选的，所述的适配体序列上的若干个位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。优选的，所述的适配体序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。优选的，所述的肿瘤标志分子核酸适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列改造成的相应的肽核酸。本专利技术还提供一套基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体在制备肿瘤标志分子检测试剂盒或检测试剂纸的应用。本专利技术突出的实质性特点和显著的进步是：本专利技术核酸适配体利用全菌消减Cell-SELEX技术筛选而得，分子量较小，易于合成与修饰，能够高特异性识别并且高亲和力结合ATG16L1、CSNK2、PPP1，与其它靶标不发生特性结合，无免疫原性，稳定易修饰，便于合成和保存，可用于检测ATG16L1、CSNK2、PPP1，并且有效地预防及控制ATG16L1、CSNK2、PPP1感染具有重要意义。利用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达目的基因的稳转细胞系，可以大大减少细胞模型的构建时间，降低模型的构建成本，能解决活细胞进行适配体筛选时靶标分子未知的难题，采用所述适配体制备的ATG16L1、CSNK2、PPP1检测试剂盒和试剂纸对ATG16L1、CSNK2、PPP1检测灵敏度高，且易于优化。其中，本专利技术仅以PPP1为例。附图说明图1是PCR退火温度优化图。3%琼脂糖凝胶电泳显示在不同温度下使用文库作为模板的PCR扩增效果，泳道1=47.2°C，泳道2=47.3°C，泳道3=47.6°C，泳道4=48.1°C，泳道5=48.8°C，泳道6=49.5°C，泳道7=50.2°C，泳道8=50.9°C，泳道9=51.6°C，泳道10=52.2°C，泳道11=52.6°C，泳道12=52.8°C.泳道M=20bpDNAladdermarker可见泳道6具有最明亮的条带，故选择泳道6温度（49.5°C）作为最优退火温度。图2是第19轮筛选产物测序比对结果图按照DNA序列中高保守区域的相似性，将测序结果分为五个家族。图3是候选适配体与293T-PPP1细胞结合荧光成像结果(400x)。图4是候选适配体与293T细胞结合荧光成像结果(400x)。图5是胰酶对PPP1-4结合能力的影响随着胰酶对靶细胞293T-PPP1处理时间的延长，PPP1-4与293T-PPP1结合的荧光强度呈逐渐减弱趋势。图6是各条适配体截短序列与靶细胞结合情况流式结果。A.与原序列相比，PPP1-4a及PPP1-4b与靶细胞293T-PPP1结合荧光强度有少许减弱，而PPP1-4c能维持与原序列相似的结合能力。B.PPP1-4a、PPP1-4b及PPP1-4c均不能与阴性细胞293T结合。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。实施例：本专利技术的基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体及应用，本实施例以PPP1为例，具体技术方案如下：1.DNA文库选择在适配体筛选过程中，随着PCR的进行，筛选产物会由特异性向非特异性发生转化。因此在进行文库选择的时候，应选择自身G/C碱基比例较高的文库，以减少PCR阶段非特异性产物的生成。本专利技术参考Kang等发表的适配体筛选相关文献所使用的文库：5’-G本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一套基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体，其特征在于：所述的适配体为SEQ ID NO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。
【技术特征摘要】
1.一套基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体，其特征在于：所述的适配体为SEQIDNO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体，其特征在于：所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列的同源性为60%以上的序列。3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体，其特征在于：所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行杂交的序列。4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体，其特征在于：所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行转录的序列。5.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9的肿瘤标志分子核酸适配体，其特征在于：所述的适配...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵永祥，张志勇，薛志刚，周素芳，张坤，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45
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