一种基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体及应用制造技术

本发明专利技术公开一种基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体及应用，属于基因工程、免疫学和肿瘤学技术领域。所述的适配体为SEQ ID NO：1~4中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。本发明专利技术核酸适配体利用全细胞消减Cell‑SELEX技术筛选而得，分子量较小，易于合成与修饰，能够高特异性识别并且高亲和力结合Endoglin，与其它细胞不发生特性结合，无免疫原性，稳定易修饰，便于合成和保存。用所述适配体制备的Endoglin检测试剂盒和试剂纸对Endoglin检测灵敏度高，且易于优化。在肿瘤诊断、肿瘤预后与监测的评估，肿瘤诊断中应用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体及应用
本专利技术属于基因工程、免疫学和肿瘤学
，特别涉及一种基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体及应用。
技术介绍
肿瘤血管内皮细胞是肿瘤血管生成的基础，对肿瘤生长及转移具有非常重要的作用。针对肿瘤血管内皮细胞进行肿瘤早期诊断与治疗，已成为肿瘤相关研究发展的必然趋势。Endoglin是肿瘤血管内皮细胞表面的一种跨膜糖蛋白，在活跃增殖的血管内皮细胞中过表达，而在正常血管内皮细胞中不表达或弱表达。因此，Endoglin被公认为肿瘤血管生成和新生血管形成的特异性标记。核酸适配体是一类能与靶分子高特异性高亲和力结合的DNA或RNA序列，具有与抗体类似的作用，常常被称为“化学抗体”。近年来，随着核酸适配体筛选技术的不断发展，越来越多的肿瘤相关核酸适配体序列被人们所发现。然而，这些肿瘤相关的核酸适配体常常仅能识别一种肿瘤细胞或一种肿瘤，很大程度限制了核酸适配体的应用。目前，能特异性靶向肿瘤血管的适配体筛选还尚未见报道。CRISPR/Cas9技术作为近几年的热门技术，是众多学者研究和应用的对象，CRISPR/Cas9技术对靶细胞目的基因进行靶向敲除（Knockout）或敲入（Knockin）多是用于基因治疗，运用此方式构建细胞模型进行进一步生物学研究还有待开发。目前，Cell-SELEX进行核酸适配体筛选多是针对不同种类的未知靶点的肿瘤细胞进行。但不同肿瘤细胞之间具有差异性，缺乏共同的靶标分子，Endoglin作为各种实体肿瘤血管中均表达的靶分子，具有普遍性。利用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达目的基因的稳转细胞系，可以大大减少细胞模型的构建时间，降低模型的构建成本，能解决活细胞进行适配体筛选时靶标分子未知的难题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体及应用。为实现本专利技术的目的所使用的技术方案为：本专利技术的一种基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体，所述的适配体为SEQIDNO：1~4中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。优选的，所述的适配体具有与SEQIDNO：1~4所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列的同源性为60%以上的序列。优选的，所述的适配体具有与SEQIDNO：1~4所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行杂交的序列。优选的，所述的适配体具有与SEQIDNO：1~4所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行转录的序列。优选的，所述的适配体序列上的若干个位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。优选的，所述的适配体序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。优选的，所述的Endoglin核酸适配体具有与SEQIDNO：1~4所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列改造成的相应的肽核酸。本专利技术还提供一种基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体在制备Endoglin检测试剂盒或检测试剂纸的应用。本申请在筛选方法的选择上，使用Cell-SELEX筛选方法。尽管靶标分子Endoglin为一种细胞膜表面蛋白，本专利技术并未使用传统蛋白筛选方法，而是使用Cell-SELEX筛选方法，并且人工构建稳定表达靶标分子Endoglin的293T细胞系（293T-hE）作为正筛选细胞。本方法有效避免了体外人工合成蛋白与细胞膜蛋白天然构象的差异，同时也解决了靶标细胞获取困难的问题。此外，本专利技术选择的正反筛选细胞仅具有Endoglin单一分子的表达差异，这使得筛选所获得的适配体具有更加准确的靶向性，简化了后续筛选完成时所需的靶点确认考察等相关步骤，优化了实验程序。在候选适配体的验证考察阶段，得到的适配体也可与靶细胞以外的其他具有Endoglin表达的细胞（如HUVEC细胞）结合，这也证实了本专利技术筛选方法切实可行。本专利技术突出的实质性特点和显著的进步是：本专利技术一种基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体，利用全菌消减Cell-SELEX技术筛选而得，分子量较小，易于合成与修饰，能够高特异性识别并且高亲和力结合Endoglin，与其它细菌不发生特性结合，无免疫原性，稳定易修饰，便于合成和保存，可用于检测Endoglin，并且有效地预防及控制Endoglin感染具有重要意义。用所述适配体制备的Endoglin检测试剂盒和试剂纸对Endoglin检测灵敏度高，且易于优化。附图说明图1是CD105蛋白抗体（PE）染色后检测两种细胞的表达。A.293T细胞CD105蛋白的表达仅为0.2%；B.293T-CD105细胞CD105蛋白的表达量为99.2%。图2是富集文库对于293T(A)细胞及293T-CD105细胞(B)结合力验证。A.293T细胞表面的荧光强度随着筛选轮数的增加几乎没有变化。B.293T-CD105细胞膜表的荧光强度随着筛选轮数的增加而增强。图3是四条适配体分别与293T-CD105细胞相结合的Kd值。图4是各条序列适配体截短序列与靶细胞结合情况流式结果。图5是hE2-c适配体在小鼠体内的活体成像结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。实施例本专利技术的一种基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体及应用，通过以下方式实现：1.构建表达人Endoglin基因的293T-CD105细胞株利用CRISPR/Cas9技术将pCAG-ENG(cDNA)-pA-PuroR基因插入到人胚肾上皮细胞株293T细胞的hAAVS1位点中，构建稳定表达人Endoglin的293T-CD105细胞，同时构建转染空载体的293T细胞作为阴性对照细胞。在筛选之前，需对靶细胞和对照细胞Endoglin蛋白的表达情况进行考察。本专利技术中，使用人CD105-PE抗体与靶细胞293T-CD105和对照细胞293T进行孵育，使用流式细胞术对其Endoglin的表达情况进行鉴定。结果如附图1所示，转染了人Endoglin基因的293T-CD105细胞CD105蛋白的表达量为99.2%，且经过多次检测表达稳定。而对照细胞及转染了空载体的293T细胞CD105的表达量仅为0.2%，几乎不表达。说明将293T-CD105细胞作为正筛选细胞，293T细胞作为反筛选细胞，筛选靶向Endoglin蛋白的核酸适配体是可行的。细胞适配体的筛选是一个多轮重复的过程，筛选成功与否与很多因素密切相关，为了提高筛选效率，保证筛选成功，应注意以下操作：（1）用于筛选的细胞状态与筛选文库的富集程度密切相关。细胞状态决定细胞膜表面蛋白的表达情况，状态不好时可能会导致靶蛋白的缺失或改变，且本专利技术中正反筛选细胞均贴壁能力较差，状态差时会使筛选过程中细胞脱落造成洗涤困难。此外，用于筛选的细胞需保证均匀分部且贴壁生长24-48小时，保证细胞充分伸展，与文库孵育时有最大的接触面积。台盼蓝染色可用于检测筛选细胞的活力，应保证细胞活力大于90%，避免筛选过程中死细胞造成非特异性结合。（2）筛选之前，将ssDNA文库在95°C变性5min使其恢复空间结构，保证文库与靶细胞的结合。结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体，其特征在于：所述的适配体为SEQ ID NO：1~4中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体，其特征在于：所述的适配体为SEQIDNO：1~4中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体，其特征在于：所述的适配体具有与SEQIDNO：1~4所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列的同源性为60%以上的序列。3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体，其特征在于：所述的适配体具有与SEQIDNO：1~4所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行杂交的序列。4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体，其特征在于：所述的适配体具有与SEQIDNO：1~4所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行转录的序列。5.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9的Endoglin核酸适配体，其特征在于：所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永祥，张志勇，薛志刚，张坤，钟莉娉，蒋雅峰，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45