一套HDACs核酸适配体制造技术

本发明专利技术公开一套HDACs核酸适配体，属于基因工程、免疫学和肿瘤学技术领域。所述的适配体为SEQ ID NO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。本发明专利技术核酸适配体利用蛋白SELEX技术筛选而得，分子量较小，易于合成与修饰，能够高特异性识别并且高亲和力结合HDACs，与其它蛋白不发生特性结合，无免疫原性，稳定易修饰，便于合成和保存。用所述适配体制备的HDACs检测试剂盒和试剂纸对HDACs检测灵敏度高，且易于优化。在肿瘤诊断、肿瘤预后与监测的评估，肿瘤诊断中应用。

【技术实现步骤摘要】
一套HDACs核酸适配体
本专利技术属于基因工程、免疫学和肿瘤学
，特别涉及一套HDACs核酸适配体。
技术介绍
癌症通常被认为是一种由致癌基因激活或肿瘤抑制基因丢失导致的遗传缺陷疾病。然而，表观遗传变化包括组蛋白乙酰化，也有助于肿瘤的发展。组蛋白乙酰转移酶和脱乙酰基酶（HDACs）在染色质结构修饰和基因表达中发挥重要作用。组蛋白乙酰转移酶失活与肿瘤发生有关。异常的HDAC活性被认为是肿瘤形成中的关键，因为HDAC过度不适当的活性抑制肿瘤抑制基因的转录。核酸适配体是经过筛选得到的用于结合特定靶标的短的单链DNA‍（single-strandedDNA,ssDNA）或RNA分子，具有易于合成，免疫原性较低，分子量小（10-15kDa）等优势。因为具有与抗体类似的作用，因此又被称为“化学抗体”。核酸适配体的出现为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的识别工具，尤其在肝癌早期诊断方面展示了良好的应用前景。目前尚未有HDACs适配体筛选的报道，若能够筛选出能够特异性结合HDACs的适配体，无疑为HDACs的检测提供更宽广的平台。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供分子量较小，易于合成与修饰的一套HDACs核酸适配体。为实现本专利技术的目的，是以HDAC1为例，所使用的技术方案为：本专利技术的一套HDACs核酸适配体，所述的适配体为SEQIDNO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。优选的，所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列的同源性为60%以上的序列。优选的，所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行杂交的序列。优选的，所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行转录的序列。优选的，所述的适配体序列上的若干个位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。优选的，所述的适配体序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。优选的，所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列改造成的相应的肽核酸。本专利技术还提供一套HDACs核酸适配体在制备HDACs检测试剂盒或检测试剂纸的应用。本专利技术突出的实质性特点和显著的进步是：本专利技术核酸适配体利用蛋白SELEX技术筛选而得，分子量较小，易于合成与修饰，能够高特异性识别并且高亲和力结合HDACs，与其它蛋白不发生特性结合，无免疫原性，稳定易修饰，便于合成和保存，可用于检测HDACs，并且有效地预防及控制HDACs具有重要意义。用所述适配体制备的HDACs检测试剂盒和试剂纸对HDACs检测灵敏度高，且易于优化。附图说明图1是优化筛选文库的PCR退火温度的琼脂糖凝胶电泳。泳道1-13：20bpladdermarker，47.0℃，47.3℃，47.9℃，48.9℃，50.1℃，50.5℃，53.0℃，54.4℃，55.7℃，56.8℃，57.5℃，57.9℃。筛选文库的扩增条带均处于78bp的位置，且53℃的条带最为单一且清晰明亮。图2是流式细胞术用于监测与HDAC1蛋白或空白镍磁珠结合的筛选文库的富集进程。A.Ni-beads表面的荧光强度随着筛选轮数的增加变化并不明显；B.HDAC1-beads表面的荧光强度随着筛选轮数的增加而逐渐增强。图3是第11轮筛选产物测序序列比对结果图。按照比对结果的结构特点，将测序结果分为五个家族。图4是五条候选核酸适配体与靶蛋白结合的平衡解离常数。A.Kd(HDAC1-1)=38.56±31.24nM；B.Kd(HDAC1-2)=14.96±12.77nM；C.Kd(HDAC1-3)=37.54±16.48nM；D.Kd(HDAC1-4）=80.57±65.70nM；E.Kd(HDAC1-5)=3.92±11.40nM。图5是HDAC1-2及其截短序列的二级结构预测。图6是流式细胞术用于考察各适配体截短序列与HDAC1靶蛋白的结合能力。A.HDAC1-2a、HDAC1-2b及HDAC1-HDAC1-2c均不能与反筛的空白镍磁珠结合。B.与原序列HDAC1-2相比，HDAC1-2a及HDAC1-2c与HDAC1蛋白结合的荧光强度仍在较强的水平，而HDAC1-2b与HDAC1蛋白的结合能力大幅度下降。图7是适配体与HDAC1蛋白的结合条件的优化。A.温度因素；B.pH值因素；C.一价阳离子因素；D.二价阳离子因素。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术方案做进一步详细描述，下述说明仅以HDAC1为例，是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。实施例本专利技术的HDACs核酸适配体，是以HDAC1为例，具体技术方案为：1.优化PCR程序中的退火温度ssDNA文库的PCR程序中的退火温度对整个筛选过程影响较大，因此，为使每轮筛选的PCR扩增达到最高效率，在筛选开始之前需优化ssDNA文库的PCR程序中退火温度。PCR具体体系如表1所示：表1PCR退火温度优化反应体系反应成分体积10xPCRBuffer2μLdNTP（2.5mM）1.6μLFP（10μM）0.8μLRP（10μM）0.8μLTaqDNAPolymerase（5u/μL）0.2μLTemplate2μLH2O12.6μL具体操作步骤如下：按表格配制12管PCR反应混合物，混匀，平均分装至12个PCR管中，每管20μL，标记T1-T12。PCR反应条件设置如下：94°C预变性3min；94°C变性30sec，某一温度退火30sec，72°C延伸30sec，扩增9个cycles；最后72°C延伸5min。上述的退火温度设置47℃-58℃共12个温度点，具体温度由PCR仪器自动生成。将PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳。分别从不同退火温度的PCR管中取出5μL与1μL6´上样缓冲液（6´LoadingBuffer）混匀之后，取出5μL混合液点样至凝胶上样孔中。DNAmarker的上样量为3μL。因本实验中目的条带为78个碱基，因此选用较小的20bpDNAladder。电泳时电压调节至100mV，电泳时间约为30min。电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，在凝胶成像系统中观察并拍照，选取条带最明亮、无弥散现象的对应的循环数作为最佳退火温度。附图1的琼脂糖凝胶电泳结果显示，筛选文库的扩增条带均处于78bp的位置，其中53℃的退火温度的条带最为单一且清晰明亮，故此文库和引物可以用于进行适配体的筛选，选取53℃作为最佳退火温度。2.筛选过程取公司合成文库粉末或上一轮筛选得到的干燥的次级文库，4℃下14000rpm离心3min，加入适量灭菌水溶解文库，终浓度为100μM。每轮筛选前，均需对初筛文库或上一轮筛选得到的文库进行预处理，即将ssDNA文库溶解在结合缓冲液中，混匀，置于95°C干式恒温器热变性5min后，立即转移至冰上冷却10min，使其形成较为稳定的二级结构。首轮筛选时先将5nmolssDNA随机文库溶解于500μL洗涤缓冲液，按照上述步骤1进行预处理后，加入10μL100×tRNA和10μL100×BSA，置于4℃中备用。以后每轮筛选的次级文库均为上一轮的筛选产物，将200pmol次级文库溶解在20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一套HDACs核酸适配体，其特征在于：所述的适配体为SEQ ID NO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。

【技术特征摘要】
1.一套HDACs核酸适配体，其特征在于：所述的适配体为SEQIDNO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。2.根据权利要求1所述的HDACs核酸适配体，其特征在于：所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列的同源性为60%以上的序列。3.根据权利要求1所述的HDACs核酸适配体，其特征在于：所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行杂交的序列。4.根据权利要求1所述的HDACs核酸适配体，其特征在于：所述的适配体具有与SEQIDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行转录的序列。5.根据权利要求1所述的HDACs核酸适配体，其特征在于：所述的适配体具有与SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永祥，张志勇，张坤，周素芳，黄勇，阳诺，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45