一种体内筛选的剪切RNA的锤头状核酶制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种体内筛选核酶的新方法，以及通过该方法筛选得到的具有催化RNA剪切活性的核酶。该体内筛选方法以毒蛋白ibsC为报告基因，通过体内转录得到的核酶对ibsC对应的mRNA的剪切作用控制毒性蛋白的表达以影响细胞存活，从而筛选获得活性核酶。该方法无需复杂的体外筛选步骤，最大程度降低无活性的RNA序列对筛查成功率的影响，为核酶进化提供了简单、高效的通用细胞内筛选平台。该方法筛选获得的核酶与底物的作用方式主要为分子间剪切模式，适用于胞外、原核细胞内、真核细胞内针对目标底物分子的位点特异性的催化剪切，实现对选定基因的表达下调。

【技术实现步骤摘要】
一种体内筛选的剪切RNA的锤头状核酶
本专利技术涉及一种体内筛选得到的具有催化RNA剪切活性的RNA分子。
技术介绍
核酶是具有催化功能的单链核酸大分子(Ribozyme)。根据其分子量的大小，可分为大分子核酶和小分子核酶两类。小核酶包括锤头状核酶(HammerheadRibozymes，HHRz)、Varkud卫星核酶、丁型肝炎病毒核酶、发夹状核酶、缠绕型核酶、手枪型核酶、短斧型核酶等，其大小介于30到150核苷酸，催化自己在特定位置发生分子内剪切反应。其中，锤头状核酶、发夹状核酶和丁型肝炎病毒核酶等催化分子内剪切反应的核酶可通过改造变成催化分子间反应的核酶。利用这些核酶具有特异剪切RNA的特性，核酶可能在人RNA病毒性疾病治疗和预防中发挥重要作用，此外，致癌基因的RNA也可以作为核酶的靶标。针对HIV-1的研究表明，细胞实验中靶向HIV-1的RNA的发夹型核酶和锤头状核酶可有效抑制多种HIV-1病株的复制，并且以HIV-1的RNA为靶标的锤头状核酶也是目前唯一报道的进入临床二期实验的核酶。但是核酶在体内的应用面临巨大的挑战。天然发现的核酶都是催化分子内剪切的，其催化分子内剪切的能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞内筛选催化分子间剪切核酶的策略，其特征在于，以细胞为筛选载体，毒蛋白IbsC为报告基因，构建含有IbsC毒性蛋白基因和核酶DNA文库的质粒文库，将质粒文库转入细胞后，通过核酶对毒性蛋白mRNA的剪切作用控制毒性蛋白的表达，进而影响细胞存活，从而筛选获得活性核酶。

【技术特征摘要】
1.一种细胞内筛选催化分子间剪切核酶的策略，其特征在于，以细胞为筛选载体，毒蛋白IbsC为报告基因，构建含有IbsC毒性蛋白基因和核酶DNA文库的质粒文库，将质粒文库转入细胞后，通过核酶对毒性蛋白mRNA的剪切作用控制毒性蛋白的表达，进而影响细胞存活，从而筛选获得活性核酶。2.根据权利要求1所述的细胞内筛选催化分子间剪切核酶的策略，其特征在于，具有剪切活性的核酶HHRz可以剪切毒蛋白mRNA导致其表达下调，细菌可在筛选平板上形成单克隆；但无活性的核酶HHRzm不能剪切毒蛋白mRNA，毒蛋白基因超表达使得细菌死亡而不能在筛选平板上形成克隆，从而将非活性序列从中筛选剔除，仅筛选出有活性的核酶序列。3.根据权利要求1所述的质粒文库，其特征在于，核酶与毒蛋白由不同的启动子起始表达并分别独立表达；核酶的转录表达由自身的启动子和终止子控制，核酶DNA文库构建到tRNA基因的反密码子环序列中以保证转录所得的核酶的稳定性；核酶的底物结合区域与IbsC毒性蛋白基因转录所得的部分mRNA互补，以形成核酶与IbsC毒性蛋白基因分子间剪切的模型；毒蛋白基因的表达由自身的启动子、核糖体结合位点、乳糖操纵子序列和终止子控制，在毒蛋白基因的N端融合表达一个额外的蛋白基因，以此提高核酶与底物的相对比例以增强核酶在体内的剪切。4.一种具有位点特异性内切核酸酶活性的核酶，其特征在于，由第一底物结合区域、大催化活性中心、茎环结构(茎2和突环2)、小催化活性中心、第二底物结合区域组成；大催化活性中心含有7个碱基CUGAUGA(SEQIDNO19)，...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐卓，黄鑫，董娟，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51