一种体内筛选的剪切RNA的锤头状核酶制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种体内筛选核酶的新方法，以及通过该方法筛选得到的具有催化RNA剪切活性的核酶。该体内筛选方法以毒蛋白ibsC为报告基因，通过体内转录得到的核酶对ibsC对应的mRNA的剪切作用控制毒性蛋白的表达以影响细胞存活，从而筛选获得活性核酶。该方法无需复杂的体外筛选步骤，最大程度降低无活性的RNA序列对筛查成功率的影响，为核酶进化提供了简单、高效的通用细胞内筛选平台。该方法筛选获得的核酶与底物的作用方式主要为分子间剪切模式，适用于胞外、原核细胞内、真核细胞内针对目标底物分子的位点特异性的催化剪切，实现对选定基因的表达下调。

【技术实现步骤摘要】
一种体内筛选的剪切RNA的锤头状核酶
本专利技术涉及一种体内筛选得到的具有催化RNA剪切活性的RNA分子。
技术介绍
核酶是具有催化功能的单链核酸大分子(Ribozyme)。根据其分子量的大小，可分为大分子核酶和小分子核酶两类。小核酶包括锤头状核酶(HammerheadRibozymes，HHRz)、Varkud卫星核酶、丁型肝炎病毒核酶、发夹状核酶、缠绕型核酶、手枪型核酶、短斧型核酶等，其大小介于30到150核苷酸，催化自己在特定位置发生分子内剪切反应。其中，锤头状核酶、发夹状核酶和丁型肝炎病毒核酶等催化分子内剪切反应的核酶可通过改造变成催化分子间反应的核酶。利用这些核酶具有特异剪切RNA的特性，核酶可能在人RNA病毒性疾病治疗和预防中发挥重要作用，此外，致癌基因的RNA也可以作为核酶的靶标。针对HIV-1的研究表明，细胞实验中靶向HIV-1的RNA的发夹型核酶和锤头状核酶可有效抑制多种HIV-1病株的复制，并且以HIV-1的RNA为靶标的锤头状核酶也是目前唯一报道的进入临床二期实验的核酶。但是核酶在体内的应用面临巨大的挑战。天然发现的核酶都是催化分子内剪切的，其催化分子内剪切的能力依赖于完整的核酶分子自身形成的特定高级结构。但转化为催化分子间剪切的核酶时，往往只能保持核酶的部分序列，从而使得核酶的催化效率下降。比如锤头状核酶(SEQIDNO5)在细胞内的高效剪切依赖突环1和突环2之间的相互作用(图1A)，这样的相互作用可以稳定锤头状核酶的催化结构使得锤头状核酶在生理条件下也能高效地催化自剪切。但是，突环1和突环2之间的相互作用在分子间剪切的锤头状核酶中是不可能存在的——在靶基因上寻找符合核酶剪切位点并且在其下游6个核苷酸的位置上有特定组成序列的RNA可能性很小或者难度太大。因此需要筛选完全不依赖这种相互作用就能通过分子间剪切的模式高效催化底物RNA降解的锤头状核酶，把适应分子内剪切的核酶进化为适应分子间剪切的核酶，这样才能推动核酶作为工具在体内的应用。为了促进HHRz的应用，已有很多研究通过体外筛选的方式来改变核酶的催化特性。体外筛选能从1013-1015数量级的随机库中，经过多轮循环筛选出具有特定活性的RNA分子，以此来优化HHRz的催化特性。但是体外筛选HHRz多是在高Mg2+浓度(10mM或更高)下进行的，远高于细胞内的Mg2+浓度(小于1mM)，而且体外筛选很难模拟细胞内复杂的化合物和生物分隔作用。体外筛选的核酶用于体内剪切时可能效果并不好，这也解释了为什么多数利用HHRz剪切细胞内靶基因的工作都是基于野生型HHRz设计的。但是野生型HHRz的序列和结构是与分子内剪切相适应的，这可能是导致基于野生型HHRz设计的核酶工具在HIV-1等疾病治疗中效果并不显著的重要原因之一。因此，需要通过细胞内筛选的方式获得能高效催化RNA分子间剪切的HHRz，才能促进核酶在相关领域的发展。
技术实现思路
本专利技术建立的体内筛选核酶的技术方案为(图1C)：以细胞为筛选载体，IbsC毒性蛋白基因实施体内筛选的信号报告，通过核酶对毒性蛋白mRNA的剪切作用控制毒性蛋白的表达，进而影响细胞存活，从而判断是否筛选获得了活性核酶。具体为：首先构建含有IbsC毒性蛋白基因和核酶DNA文库的质粒文库。核酶与毒蛋白由不同的启动子起始表达。核酶的转录表达由自身的启动子和终止子控制，核酶DNA文库构建到tRNA基因的反密码子环序列中以保证转录所得的核酶的稳定性。为了实现IbsC的信号报告功能，核酶的底物结合区域与IbsC毒性蛋白基因转录所得的部分mRNA互补，以形成核酶与底物(IbsC毒性蛋白基因)分子间剪切的模型，即相应的核酶DNA文库的底物结合区域序列应与IbsC毒性蛋白基因序列满足相应要求。毒蛋白基因的表达由自身的启动子、核糖体结合位点、乳糖操纵子序列和终止子控制；为减缓其表达速度，在毒蛋白基因的N端融合表达一个额外的蛋白基因，以此提高核酶与底物的相对比例以增强核酶在体内的剪切。由于核酶和报告基因IbsC分别表达，核酶通过分子间剪切控制毒蛋白基因的表达。具有剪切活性的核酶HHRz可以剪切毒蛋白mRNA导致其表达下调，细菌可在筛选平板上形成单克隆。但无活性的核酶HHRzm不能剪切毒蛋白mRNA，毒蛋白基因超表达使得细菌死亡而不能在筛选平板上形成克隆(图1C)，从而将非活性序列筛选剔除，仅筛选出有活性的核酶序列。通过该方法，仅有催化分子间剪切活性的核酶才能被筛选出来，没有活性的核酶直接从筛选库去除，是一种能去除背景的正向筛选方式。通过上述体内筛选技术方案得到的核酶的结构如图1B所示：由第一底物结合区域、大催化活性中心、茎环结构(茎2和突环2)、小催化活性中心、第二底物结合区域组成。大催化活性中心、茎2和突环2、小催化活性中心构成核酶的催化核心区域。大催化活性中心含有7个碱基CUGAUGA(SEQIDNO19)，小催化活性中心含有4个碱基GAAA(SEQIDNO20)，茎2和突环2连接两个催化活性中心。茎2通过碱基互补配对的方式形成茎结构，有3～8个碱基配对；突环2的序列长度为3～8个碱基；在优选方案中，茎2和突环2序列(下称“茎环序列”)可以为SEQIDNO21、SEQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24、SEQIDNO25、SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO28、SEQIDNO29所述序列。两个底物结合区域分别与预先选定的RNA底物通过碱基互补配对的方式结合，底物结合区域序列可以根据不同底物的序列而发生相应的变化；底物结合区域的长度可以变化，只需与预先选定的RNA底物序列结合形成稳定的双链结构即可。上述锤头状核酶特异性识别的剪切位点位于底物的第一底物结合区域和第二底物结合区域之间，其序列规则为“NUX”，N表示随机碱基(N＝A或T或C或G)，X表示除了G以外其他三个碱基(N＝A或T或C)，并在X后发生特异剪切。“NU”与锤头状核酶序列相互作用以配对碱基的形式存在，“X”以非配对碱基形式存在。为了生成剪切效率更高的剪切RNA的核酶，可以在茎2和突环2采用多种取代、缺失、插入、复制和其它突变的方法来制备属于公开范围的分子，只要所述分子表现出了此处描述的位点特异性的剪切活性，那么它们就属于本说明书的范围之内。本专利技术筛选所得核酶的特点在于剪切方式主要为分子间剪切，也可以通过构建分子内的剪切模式发挥作用。在一个实施实例中，同一种核酶可以在原核生物中剪切序列不同的底物SEQIDNO10、SEQIDNO11。在一个实施实例中，同一种核酶可以在真核生物中剪切序列不同的底物SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO13。术语定义：以下术语应该是文中提到的。核酶：核酶是一种具有催化功能的单链RNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。此处能够和核酶互换使用的其他词汇是“催化活性RNA分子”，“Ribozyme”，无论这些分子是通过合成制备的或是来自有机体或其它来源，它们都应该被理解为包括其酶促活性部分。碱基互补配对：指DNA或RNA的单链分子或节段中的一段核苷酸序列与另一条寡核苷酸单链的序列充分地互补从而通过氢键特异性地杂合在一起。分子内剪切：核酶分子催化底物分子发生剪切，核酶和底物在同一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞内筛选催化分子间剪切核酶的策略，其特征在于，以细胞为筛选载体，毒蛋白IbsC为报告基因，构建含有IbsC毒性蛋白基因和核酶DNA文库的质粒文库，将质粒文库转入细胞后，通过核酶对毒性蛋白mRNA的剪切作用控制毒性蛋白的表达，进而影响细胞存活，从而筛选获得活性核酶。

【技术特征摘要】
1.一种细胞内筛选催化分子间剪切核酶的策略，其特征在于，以细胞为筛选载体，毒蛋白IbsC为报告基因，构建含有IbsC毒性蛋白基因和核酶DNA文库的质粒文库，将质粒文库转入细胞后，通过核酶对毒性蛋白mRNA的剪切作用控制毒性蛋白的表达，进而影响细胞存活，从而筛选获得活性核酶。2.根据权利要求1所述的细胞内筛选催化分子间剪切核酶的策略，其特征在于，具有剪切活性的核酶HHRz可以剪切毒蛋白mRNA导致其表达下调，细菌可在筛选平板上形成单克隆；但无活性的核酶HHRzm不能剪切毒蛋白mRNA，毒蛋白基因超表达使得细菌死亡而不能在筛选平板上形成克隆，从而将非活性序列从中筛选剔除，仅筛选出有活性的核酶序列。3.根据权利要求1所述的质粒文库，其特征在于，核酶与毒蛋白由不同的启动子起始表达并分别独立表达；核酶的转录表达由自身的启动子和终止子控制，核酶DNA文库构建到tRNA基因的反密码子环序列中以保证转录所得的核酶的稳定性；核酶的底物结合区域与IbsC毒性蛋白基因转录所得的部分mRNA互补，以形成核酶与IbsC毒性蛋白基因分子间剪切的模型；毒蛋白基因的表达由自身的启动子、核糖体结合位点、乳糖操纵子序列和终止子控制，在毒蛋白基因的N端融合表达一个额外的蛋白基因，以此提高核酶与底物的相对比例以增强核酶在体内的剪切。4.一种具有位点特异性内切核酸酶活性的核酶，其特征在于，由第一底物结合区域、大催化活性中心、茎环结构(茎2和突环2)、小催化活性中心、第二底物结合区域组成；大催化活性中心含有7个碱基CUGAUGA(SEQIDNO19)，...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐卓，黄鑫，董娟，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51