利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小菜蛾APN1基因及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR/Cas9实现非模式生物小菜蛾APN1基因的敲除及其在Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性机制分子研究中的应用。本发明专利技术方法设计并合成小菜蛾APN1基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统筛选出可稳定遗传的小菜蛾APN1基因纯合突变种群并用于Bt Cry1Ac杀虫蛋白毒力生物测定，证实小菜蛾APN1基因突变可以导致其对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生高抗性。本发明专利技术方法简单高效，省时省力，不仅为非模式生物体内功能基因的深入研究提供技术支撑，也为探索新的害虫防治策略奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小菜蛾APN1基因及其应用
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及小菜蛾APN1基因的敲除以及在小菜蛾BtCry1Ac杀虫蛋白抗性分子机制研究中的应用。
技术介绍
小菜蛾[Plutellaxylostella(L.)]是一种世界性的十字花科作物专食性害虫，也是目前抗药性最为严重的害虫之一，其交互抗性谱广、抗性水平高、发展速度快。并且随着十字花科蔬菜在各地的广泛栽培，小菜蛾已对世界十字花科蔬菜的生产造成极大的威胁。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)能产生Cry类杀虫晶体蛋白，对多种昆虫具有特异性毒杀作用，是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的95%以上，因其对害虫高效、对人畜安全、对环境友好而在世界范围内得到广泛的应用。小菜蛾是最早被报道在田间对Bt杀虫剂产生高抗性的害虫，自从第一例来自美国夏威夷的田间抗性报道以来，在日本、马来西亚以及我国的深圳、广州等地区的田间小菜蛾也对Bt均产生了不同程度的抗性。因此，寻找合理的科学手段研究小菜蛾Bt抗性分子机制，从根本上解决害虫抗药性问题就显得尤为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas9技术的小菜蛾APN1基因的敲除方法。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9技术的小菜蛾APN1基因的敲除方法。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，设计并合成小菜蛾APN1基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以小菜蛾四龄幼虫新鲜蛹蜕的痕量gDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增和直接测序鉴定G0代突变个体，G0代突变个体相互交配获得G1代，直接和TA测序鉴定后选取数量足够且具有相同突变型的杂合子个体进行自交获得G2代，TA测序鉴定得到能稳定遗传的G2代纯合子个体，随后自交获得G3代的APN1纯合基因突变型种群。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，sgRNA靶标序列设计在小菜蛾APN1基因编码区的第12个外显子，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，sgRNA靶标位点的合成引物为：CR...

【专利技术属性】
技术研发人员：张友军，郭兆将，孙丹，康师，郭乐，周君雷，龚莉君，覃舰莹，朱流红，白杨，罗亮，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11