一种香蕉枯萎菌milRNA制造技术

本发明专利技术公开了一种香蕉枯萎菌编码内源milRNA。本发明专利技术通过Deep sequencing深度测序获得了香蕉枯萎菌编码的内源milRNA，为后续进一步开发、利用小RNA在香蕉枯萎菌中的作用机制提供前期工作铺垫。

【技术实现步骤摘要】
一种香蕉枯萎菌milRNA本申请为申请号CN201810175831.0，申请日20180302，专利技术名称“香蕉枯萎菌milRNAs及低丰度milRNAs的体外验证方法”的中国专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及生物
，具体涉及香蕉枯萎菌milRNA。
技术介绍
1、植物内源miRNA在转录后以基因沉默的方式负调控靶标基因的表达，在植物生长发育、抗逆抗病等多个方面发挥重要的作用真核生物的小RNA主要分为microRNAs(miRNAs)、siRNAs和piRNAs。miRNA和siRNA长度约为20～25nt，均由类似RNaseIII的核酸内切酶Dicer(或Dicer类似蛋白)加工产生，它们的形成既有联系又有区别。siRNA途径是由是外源入侵，如病毒，转座子以及转基因等产生变体dsRNA引发的；而miRNA途径由内源性hpRNA诱导。siRNA和miRNA都由DCLs(或Dicer类似蛋白)剪切形成，其中与mRNA互补的链结合RNA诱导的沉默复合体(RNA-InducedSilencingComplex,RISC)，以PTGS的方式作用序列同源的mRNA，通过mRNA剪切、翻译抑制或者甲基化等方式调控基因的表达。piRNA依赖PiWi蛋白加工成熟，仅存在动物细胞。植物内源miRNA是由Ⅲ型RNase核酸酶Dicer从含有茎环结构的内源转录本中切割产生一类21-24nt长度的小分子非编码RNA，通过转录后水平以mRNA剪切或翻译抑制的方式沉默序列同源的mRNA靶标基因。miRNA基因广泛分布于植物基因组中，在基因组上通常具有独立的基因座位(1ocus)，转录产物自身折叠成不完全配对的发卡结构(hairpin)。已经有大量的报道证实植物内源miRNAs参与植物对病原菌的PTI和ETI免疫，在植物生长发育、抗逆抗病等多个方面发挥重要的作用。2、真菌中存在与植物miRNA在结构、长度、作用方式上类似的小RNAs(microRNA-likeRNAs，milRNAs)。milRNAs最早在粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)中发现的，与植物microRNA在结构、小RNA长度以及作用方式上非常相似，因为与植物的miRNA类似而命名microRNA-likes(milRNAs)。粗糙脉孢霉的milRNAs通过Dicers，QDE-2，核酸外切酶活性的QIP效应蛋白以及具有III型RNase功能域的线粒体核糖体大亚基MRPL3蛋白(mitochondrialribosomalproteinlargesubunit,MRPL3)的不同组合，产生有四种不同的生物形成途径。虽然四种途径中从基因间隔区转录的RNA前体序列长度各异，但都具有发卡结构，形成的milRNAs具有5'末端U的偏好性，能够特异与Argonaute(AGO)蛋白结合；此外，实验证明milR-1可以通过基因沉默的方式作用调靶标序列(NCU07311)mRNA，主要通过抑制mRNA翻译的方式进行，与植物microRNA通过mRNA剪切和抑制转录的方式不一致(Leeetal.,2010)。milR-1是构巢曲霉中丰度最高的miRNA-likeRNAs，Xueetal.(2012)以milR-1为研究对象构建了依赖AGO的milR-1离体生物形成的生物化学研究框架，研究表明milR-1的加工成熟过程可以分为5个步骤，与植物microRNA的生物合成途径不一样的是，除了QDE-2，Dicer等核心蛋白组分外，还需要QIP以及RNA外来复合体(exosome)的共同参与，加工成为成熟的小RNA(Xueetal.,2012)。随后，植物病原真菌的小RNA相关研究进展迅速，在稻瘟病(Magnaportheoryzae)(Nunesetal.,2011)油菜核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)(Zhouetal.,2012)葡萄灰霉菌(Botrytiscinerea)(Weibergetal.,2013；Wangetal.,2017a)疫霉(Phytophthora)(Fahlgrenetal.,2013)尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)(Chenetal.,2014)黄曲霉(Aspergillusflavus)(Baietal.,2015)小麦条锈(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)(Muethetal.,2015；Wangetal.,2017b)中陆续都发现存在milRNAs。随着技术的进步，深度测序可以预测到低丰度milRNA及其骨架序列的存在，但是由于病原真菌中大部分的milRNAs表达本底水平太低，常规的同位素32p-ATP标记的miRNA探针无法检测到低丰度的milRNAs，因此，无法对低丰度的milRNAs及其发夹序列进行验证。3、植物病原真菌与寄主之间存在跨界小RNA基因沉默，抑制寄主的免疫反应促进病原菌的侵染。病原真菌利用小RNA作为效应因子(effector)进入植物细胞内部抑制植物免疫防卫反应。灰霉菌引发的灰霉病可以侵染200多种植物。Weibergetal.(2013)的研究显示灰霉菌能够输送Bc-sRNAs进入寄主细胞通过与AGO1特异性结合抑制AGO1功能，沉默寄主的免疫相关基因促进病原菌侵染。拟南芥的Δago1缺失突变体由于丧失了AGO1功能，减少了对灰霉菌的敏感性；相反，灰霉菌的Δdcl1dcl2双突变体由于无法加工产生Bc-sRNAs而完全丧失了侵染性。因此，真菌病原物通过转移具有致病力的小RNA效应因子进入寄主细胞通过抑制寄主的防卫反应促进病原菌的侵染，该发现阐释了这种自然发生的跨界RNAi沉默现象作为病原真菌的一种更加高级的致病机制(Weibergetal.,2013)。此外，在葡萄灰霉菌(Botrytiscinerea)中还发现一个低丰度表达的Bc-siR37，仅侵染时上调表达，而Bc-siR37的3个确定的作用靶标都是寄主免疫相关的(Wangetal.,2017)。Bc-DCL1和DCL2是产生Bc-sRNAs的主要组分，沉默DCLs可以显著减少病原菌的致病力。病原菌存在环境RNAi可以吸收外部的RNA，在水果、蔬菜以及鲜花的表面施用靶向DCLs的dsRNA和sRNA可以通过调控Bc-sRNAs表达从而明显减轻灰霉病的症状(Wangetal.,2016；Wangetal.,2017a)。小RNA是病原真菌一类重要的致病因子。小麦条锈病编码的Pst-milR1仅仅在侵染时诱导表达，在Pst中通过BSMV基因沉默抑制Pst-milR1的表达明显减弱了条锈病的致病性，同时，在小麦中敲除其靶标小麦病程相关基因PR2(SM638)则增强了小麦对无毒菌株的感病性，正反实验证实Pst-milR1以跨界基因沉默方式靶向寄主免疫相关基因PR2(SM638)从而抑制寄主的免疫反应促进病原菌侵染(Wangetal.,2017b)。4、香蕉枯萎菌的研究香蕉枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.cubense,Foc)是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性土传病害，其病菌腐生能力很强,在土壤中可长期存活本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种香蕉枯萎菌milRNA，其特征在于，所述香蕉枯萎菌milRNA的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种香蕉枯萎菌milRNA，其特征在于，所述香蕉枯萎菌milRNA的基因序列如SEQIDNO:1所示。2.一种载体，其特征在于，所述载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：漆艳香，丁兆建，彭军，张欣，谢艺贤，曾凡云，刘远征，孟春亮，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46