一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其包括如下步骤：(1)溶液配制：包括样品溶液的配制、阳性对照品溶液配制、阴性对照溶液的配制、荧光生成反应液的配制；(2)微阵列芯片的制备：将对照品溶液和样品溶液点于薄层预制硅胶板上；(3)荧光猝灭图像的获取：取微阵列芯片，荧光生成反应液雾化，置于薄层图像观察仪中，曝光，采集图像；(4)数据处理：采集的图像导入TLC分析软件中进行像素分析；该方法具有样品前处理简单、通量高、成本低廉的优点；反应体系为荧光自发光系统，不会受样品本身颜色和外界光源的干扰，具有良好的专属性。

A high throughput screening method for antioxidants in medicinal materials based on fluorescence quenching principle

The invention discloses a high throughput screening method for antioxidants in medicinal materials based on fluorescence quenching principle, which comprises the following steps: (1) solution preparation: including sample solution preparation, positive reference solution preparation, negative reference solution preparation, fluorescence generation reaction solution preparation; (2) preparation of microarray chips: preparation of antioxidants; Photo solution and sample solution are dotted on thin-layer prefabricated silica gel plate; (3) acquisition of fluorescence quenching image: taking microarray chip, atomizing fluorescence reaction liquid, putting it into thin-layer image observer, exposing and collecting image; (4) data processing: the collected image is imported into TLC analysis software for pixel analysis; the method has samples. Pretreatment is simple, high throughput and low cost. The reaction system is a fluorescent self-luminescent system, which is not affected by the color of the sample itself and external light sources, and has good specificity.

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法
本专利技术属于药物
，公开了一种基于荧光猝灭原理的抗氧剂高通量筛选方法，用于抗氧剂的筛选、追踪及总抗氧化活性评价。
技术介绍
关于人类的生老病死，自由基衰老理论是较为被人们接受的理论之一。该理论认为，衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的。生物体系中的自由基主要以活性氧的形态存在，包括超氧阴离子(O2.-)，羟基自由基(OH.-)，双氧水(H2O2)等，它们是线粒体在有氧代谢过程中产生的副产物。活性氧具有高反应活性，对机体的组织、蛋白、DNA造成氧化损伤。损伤的累积会造成细胞和组织功能损伤或丧失，从而引起衰老和疾病。在生理情况下，机体内部的抗氧化系统能够清除过量的自由基从而使机体免受其伤害，达到一种氧化还原平衡状态。但在病理状况下，过量自由基的产生或抗氧化系统的失职将令机体处于一种氧化应激的状态，进而引起老化和一些退行性疾病。研究发现，外源性的抗氧剂可以阻止自由基链式反应而改变机体的氧化应激状态。绝大多数疾病与过量自由基的产生息息相关，除了少数遗传性疾病。外源性抗氧剂的补充可以大大改善患者的健康状况。最新有研究显示，甚至在出生之前补充抗氧剂也可延缓衰老。目前以“antioxidantsupplement”为关键词在ClinicalTrials.gov网站上搜索到的抗氧化补充剂的临床试验多达1000多项。目前常用的抗氧剂有维生素类(C和E)，微量元素，黄酮类和酚酸类等，诸多临床试验的效果并不尽如人意，原因可能与部分抗氧剂可能会引起炎症反应有关，因此，筛选出即具有强抗氧化活性又具有较好抗氧活性的抗氧剂显得尤为迫切。目前为止，高通量筛选抗氧剂的方法主要有96孔板法和流动注射法。复杂的样品处理过程和昂贵的精密仪器使得这些方法不仅效率低下，而且难以普及。因此，需要寻找一种简便经济的快速筛选抗氧剂的方法，并同时追踪及评价抗氧剂活性的方法。
技术实现思路
专利技术人在研发过程中发现鲁米诺作为一种荧光底物被广泛应用于刑事侦查，即使用水冲洗过犯罪现场，残留的血迹中微量的铁离子仍然可以催化鲁米诺的氧化还原反应，发出425nm的荧光用于辨认血迹。受此启示，如若有抗氧剂的存在，将与鲁米诺竞争性的抢夺氧化剂，从而降低荧光的强度。为此，我们以预制硅胶G板作为芯片载体，将样品以微阵列的形式加载于芯片上。然后依次以双氧水和鲁米诺半定量地雾化。理论上来讲，整个芯片表面应产生蓝色荧光，而具有抗氧化能力的样品点样处则会产生荧光强度的减弱。然而这样产生的荧光强度太弱，不足以被普通的图像采集设备捕获到。我们利用一种高效催化剂-铁氰化钾，大大提高了荧光效率，使得反应产生的荧光肉眼可见，且持续20～30s的时间，可以进行图像捕获进行进一步的像素分析。本专利技术建立的一种基于荧光猝灭原理的抗氧剂高通量筛选方法，具有样品前处理简单、通量高、成本低廉的优点。本专利技术的方法中反应体系为荧光自发光系统，不会受样品本身颜色和外界光源的干扰，具有良好的专属性。本专利技术是通过下述技术方案实现的：一种基于荧光猝灭原理的对药材中抗氧剂高通量筛选方法，其包括如下步骤：步骤1，溶液配制：步骤2、微阵列芯片的制备：步骤3、荧光猝灭图像的获取：步骤4、数据处理。进一步，本专利技术基于荧光猝灭原理的对药材中抗氧剂高通量筛选方法，还包括步骤5HPLC-DAD-CL/MS分析追踪活性成分的方法。该步骤能够进一步识别和指认被筛选出抗氧化活性成分。上述步骤(1)所述溶液配制包括样品溶液的配制、阳性对照品溶液配制、阴性对照溶液的配制、荧光生成反应液的配制。所述样品为药材粉末，药材为常用生药材或饮片，包括但不限于石菖蒲、贝母、枳壳、巴戟天、菊花、甘草、柴胡、三七、黄柏、党参、灵芝、西洋参、茯苓、山茱萸、桂枝、赤芍、大黄、当归、枳实、酸枣仁、白芍、青皮、黄连、天麻、桃仁、白芷、白术、人参、川赤芍、陈皮、无柄灵芝、北五味子、黄芪、红花、南五味子、升麻、川芎、紫芝、肉桂、野木瓜中一种或多种。所述样品溶液的制备：取药材粉末，加入10-30倍量(g/ml)的30～95％乙醇，超声或回流提取15～60min，即得样品溶液。优选上述样品溶液的制备中，所述乙醇浓度40-60％，最佳所述乙醇浓度为50％。所述超声提取为30min。上述步骤(1)中所述阳性对照品溶液：取VitaminC对照品，加入30～95％乙醇定容并制成终浓度为10～30mg/mL溶液。进一步优选所述乙醇浓度40-60％，最佳乙醇浓度为50％。上述步骤(1)中所述阴性对照品溶液：非还原性低聚糖类加水溶解即可。所述非还原性低聚糖类包括但不限于D-葡萄糖、果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-蔗果五糖。具体，称取D-葡萄糖、果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-蔗果五糖适量加水溶解并制成终浓度为10-30mg/mL溶液。优选，阴性对照品溶液：称取D-葡萄糖、果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-蔗果五糖适量加水溶解并制成终浓度为20mg/mL溶液。上述步骤(1)中所述荧光生成反应液包括荧光底物溶液、荧光激发液。所述荧光底物溶液是由鲁米诺用氢氧化钠溶液溶解成终浓度为(1.5～3)×10-2M的混合液。所述氢氧化钠浓度为(5～10)×10-1M。进一步优选，所述荧光底物溶液是由鲁米诺用7.50×10-1M氢氧化钠溶液溶解成终浓度为(1.5～3)×10-2M的混合液(优选2.26×10-2M)。所述荧光激发液是由铁氰化钾溶液和双氧水溶液配制成(1～2.5)×10-1M的混合溶液。所述铁氰化钾溶液浓度为(1～2)×10-1M；所述双氧水浓度为20-40％。所述荧光激发液需要临用前配制。进一步优选，用水溶解适量铁氰化钾制成终浓度为1.52×10-1M的储备液，临用前加30％的双氧水使其终浓度为1.94×10-1M作为荧光激发液。本专利技术步骤(2)中所述微阵列芯片的制备：将薄层预制硅胶板，对照品溶液和样品溶液以10×10矩阵方式点样于小板上，斑点中心距离3.5mm，用冷空气吹干板面残留溶剂，制备好的芯片置于真空干燥器内存放。本专利技术步骤(3)所述图像捕获：取微阵列芯片，首先以双氧水铁氰化钾荧光激发液雾化，然后以鲁米诺荧光底物液进行雾化，迅速置于薄层图像观察仪中，曝光，采集图像。进一步优选，图像捕获：首先以双氧水铁氰化钾荧光激发液雾化，锯齿式均匀地雾化两个“之”字形，横向纵向各一个，然后以鲁米诺荧光底物液进行雾化，五个“之”字。迅速置于薄层图像观察仪中，曝光时间8000～12,000ms，(优选102,000ms)增益1.0，进行图像采集。本专利技术采用计数交叉“之”字形雾化可以更均匀，而且达到半定量的效果。本专利技术步骤(4)数据处理：将步骤(3)采集的图像导入TLCImageAnalyzer5.0(公开号：CN104792915A公开的全部内容)进行像素分析，选取强度高和噪音低的蓝色通道进行峰面积积分，线性回归、精密度考察、热图分析等均由R(RGui64-bit,version3.2.3,Win864-bitsystem)处理生成，筛选出抗氧活性。本专利技术步骤(5)所述的HPLC-DAD-CL/MS分析追踪活性成分的方法，化学发光抗氧化图谱中较强峰对应的高效液相色谱峰具有较强抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其包括如下步骤：(1)溶液配制：包括样品溶液的配制、阳性对照品溶液配制、阴性对照溶液的配制、荧光生成反应液的配制；(2)微阵列芯片的制备：将对照品溶液和样品溶液点于薄层预制硅胶板上；(3)荧光猝灭图像的获取：用荧光生成反应液雾化微阵列芯片，置于薄层图像观察仪中，曝光，采集图像；(4)数据处理：采集的图像导入TLC分析软件中进行像素分析，筛选出抗氧活性。

【技术特征摘要】
2018.04.08 CN 20181030608161.一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其包括如下步骤：(1)溶液配制：包括样品溶液的配制、阳性对照品溶液配制、阴性对照溶液的配制、荧光生成反应液的配制；(2)微阵列芯片的制备：将对照品溶液和样品溶液点于薄层预制硅胶板上；(3)荧光猝灭图像的获取：用荧光生成反应液雾化微阵列芯片，置于薄层图像观察仪中，曝光，采集图像；(4)数据处理：采集的图像导入TLC分析软件中进行像素分析，筛选出抗氧活性。2.如权利要求1所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于，还包括步骤(5)用HPLC-DAD-CL/MS分析追踪抗氧活性成分的方法。3.如权利要求1所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：所述样品溶液的制备，取药材粉末，加入含水乙醇，超声或回流提取，即得样品溶液；所述阳性对照品溶液：取VitaminC对照品，加入含水乙醇定容即可；所述阴性对照品溶液：取非还原性低聚糖类加水溶解即可；所述荧光生成反应液包括荧光底物溶液、荧光激发液，所述荧光底物溶液是由鲁米诺用氢氧化钠溶液溶解成的混合溶液，所述荧光激发液是由铁氰化钾溶液和双氧水溶液配制成的混合溶液。4.如权利要求1所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：所述样品溶液的制备，取药材粉末，加入10～30倍量的30～95％乙醇，超声或回流提取15～60min，即得样品溶液；所述阳性对照品溶液：取VitaminC对照品，加入30～95％乙醇定容成终浓度为10～30mg/mL溶液即可；所述阴性对照品溶液：取非还原性低聚糖类加水溶解成终浓度为10～30mg/mL溶液即可；所述荧光生成反应液包括荧光底物溶液、荧光激发液，所述荧光底物溶液是由鲁米诺用氢氧化钠溶液溶解成终浓度为(1.5～3)×10-2M的混合溶液，所述荧光激发液是由铁氰化钾溶液和双氧水溶液配制成(1～2.5)×10-1M的混合溶液。5.如权利要求4所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：所述氢氧化钠浓度为(5～10)×10-1M；所述铁氰化钾溶液浓度为(1～2)×10-1M；所述双氧水浓度为20～40％。6.如权利要求1所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：步骤(2)中所述微阵列芯片的制备：将薄层预制硅胶板，对照品溶液和样品溶液以10×10矩阵方式点样于小板上，斑点中心距离3.5mm，用冷空气吹干板面残留溶剂，制备好的芯片置于真空干燥器内存放。7.如权利要求1所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：步骤(3)所述图像捕获：取微阵列芯片，首先以双氧水铁氰化钾荧光激发液雾化，然后以鲁米诺荧光底物液进行雾化，迅速置于薄层图像观察仪中，曝光，采集图像。8.如权利要求7所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于：步骤(3)所述图像捕获：首先以双氧水铁氰化钾荧光激发液雾化，锯齿式均匀地雾化两个“之”字形，横向纵向各一个，然后以鲁米诺荧光底物液进行雾化，五个“之”字，迅速置于薄层图像观察仪中，曝光时间8000～12,000ms，增益1.0，进行图像采集。9.如权利要求2所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙帅，许舜军，郭隆钢，许艺镌，许铮弟，谢培山，张和灿，
申请(专利权)人：广州卡马生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44