一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法技术

本发明专利技术涉及分析检测领域，公开了一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法。本发明专利技术所述检测方法配制不同浓度三螺旋结构香菇多糖标准品溶液，加入苯胺蓝工作液和甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液避光反应，在激发波长370‑430nm，发射波长460‑550nm条件下，测定△F，以△F和三螺旋结构香菇多糖标准品溶液浓度为坐标轴，建立标准曲线；将待测样品按照前述方法检测，测定△F，根据所述标准曲线获得待测样品中三螺旋结构香菇多糖的含量。本发明专利技术将苯胺蓝和荧光法结合，在反应阶段采用甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液作为反应介质，在特定激发波长和发射波长下进行检测，同时优化检测方法各项参数，使得所述检测方法专属性、准确性和灵敏度均较高。

A rapid detection method for letinous edodes polysaccharide with three helix structure

The invention relates to the field of analysis and detection, and discloses a rapid detection method of Lentinan with triple helix structure. The detection method of the present invention is to prepare standard solution of Lentinan with three helix structures of different concentrations, add aniline blue working solution and glycine sodium hydroxide buffer solution to avoid light reaction, and determine Delta F under the conditions of excitation wavelength 370 430 nm and emission wavelength 460 550 nm, with Delta F and triple helix structure lentinan standard solution. The concentration is coordinate axis, and the standard curve is established. The tested samples are detected according to the above method, and Delta F is determined. According to the standard curve, the content of Lentinan with triple helix structure in the tested samples is obtained. The invention combines aniline blue with fluorescence method, uses glycine sodium hydroxide buffer solution as reaction medium in the reaction stage, detects at specific excitation wavelength and emission wavelength, and optimizes various parameters of the detection method, so that the detection method has high specificity, accuracy and sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法
本专利技术涉及分析检测
，特别涉及一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法。
技术介绍
香菇(Lentinusedodes(Berk.)Sing.)属于担子菌纲伞形科真菌，是世界名贵药食两用菌。香菇多糖(Lentinan，LNT)是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，临床与药理研究表明，LNT具有明显的免疫调节功能，通过激活机体免疫系统发挥抗肿瘤、抗病毒等多种药理活性，已是现代研究的热点所在。LNT的生物学活性与其主链结构、空间构型等因素密切相关。LNT的化学结构为每5个β-(1,3)-吡喃葡萄糖苷相连为线性主链，侧链连有2个β-(1,6)-D-吡喃葡萄糖苷分支的β-(1,3)-D-葡聚糖。适度分子量的LNT在水溶液中由于氢键作用，可形成稳定的三螺旋构型。研究发现只有含三螺旋结构的LNT才具有明显的抗肿瘤活性。目前针对LNT中三螺旋结构的检测方法主要有三类：1)酶法。酶法是国际上最常用的检测方法，但步骤繁琐，不同酶种及比例对测定结果影响较大，且高活性的专一酶价格较贵；2)蛋白特异识别法。蛋白特异识别法常用鲎G因子实验法和Dectin-1检测法，同样存在步骤繁琐、价格昂贵等问题，应用有限；3)无机化学法，如苯酚-硫酸法。无机化学法只能检测多糖中总糖含量，对三螺旋结构没有专属性。专利CN107132149A公开了一种快速特异性检测凝胶多糖含量的方法，但是LNT具有特有的三螺旋结构，其无法和一般的多糖检测方法通用，容易被其他多糖干扰检测。因此，目前尚缺乏对LNT中三螺旋结构的快速、特异、高灵敏检测的分析方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法，使得所述检测方法具有较高的专属性、准确性和灵敏度，同时具备较宽的线性范围。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法，包括：步骤1、配制不同浓度三螺旋结构香菇多糖标准品溶液，加入苯胺蓝工作液和甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液避光反应，在激发波长370-430nm，发射波长460-550nm条件下，测定△F，以△F和三螺旋结构香菇多糖标准品溶液浓度为坐标轴，建立标准曲线；步骤2、将待测样品加入苯胺蓝工作液和甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液避光反应，在激发波长370-430nm，发射波长460-550nm条件下，测定△F，根据所述标准曲线获得待测样品中三螺旋结构香菇多糖的含量。针对目前缺少监测三螺旋结构香菇多糖的有效方法的问题，本专利技术将苯胺蓝和荧光法结合，以苯胺蓝荧光法进行检测，同时优化检测方法各项参数，使得所述检测方法专属性、准确性和灵敏度均较高。作为优选，所述激发波长为390-420nm，在本专利技术具体实施方式中，所述激发波长为394nm、404nm或414nm；所述发射波长为470-530nm，在本专利技术具体实施方式中，所述发射波长为472nm、482nm、492nm、502nm、512nm或522nm。作为优选，所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液为pH值为7-12、0.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，其中所述pH值可以具体为7、8、9、10、11或12。作为优选，所述△F为(F-F0)/F0，其中F表示实验组荧光强度，即标准品或待测样品溶液反应后荧光强度，F0表示空白对照组荧光强度，即苯胺蓝工作液自身荧光强度。作为优选，所述苯胺蓝工作液中苯胺蓝的质量百分比为0.05-3.2％；在本专利技术具体实施方式中，该质量百分比为0.05％、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％或3.2％。作为优选，所述避光反应的温度为40-90℃；在本专利技术具体实施方式中，所述温度为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃或90℃。作为优选，所述避光反应的时间为大于等于15min；具体地，可以是15-50min，如15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min或50min。在对本专利技术所述检测方法的方法学考察试验中，本专利技术表现出较高的精密度、准确度、稳定性以及极佳的灵敏度；其中，平行6次测定最终浓度为20μg/mL香菇多糖标准品溶液的△F，其RSD为0.93％；0、2、4、6、8、10和12h时测定香菇多糖标准品溶液的△F，其RSD为0.41％；加样回收率在99.20％-102.80％之间，平均回收率为100.65％，RSD为1.53％，证明本专利技术检测方法测定香菇多糖的准确度高；在检测限LOD的检测中，本专利技术检测方法能够检测到最小浓度为0.5μg/mL，表现出极为优秀的灵敏度。此外，在检测方法专属性的考察实验中，添加50倍浓度以内的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、纤维素、淀粉、黄原胶、党参多糖和木聚糖对荧光测定均无影响，说明该方法专属性良好。由以上技术方案可知，本专利技术将苯胺蓝和荧光法结合，在反应阶段采用甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液作为反应介质，在特定激发波长和发射波长下进行检测，同时优化检测方法各项参数，使得所述检测方法专属性、准确性和灵敏度均较高。附图说明图1所示不同激发波长和发射波长下对本专利技术检测方法△F的影响结果；其中，Ex.表示激发波长，Em.表示发射波长；图2所示不同苯胺蓝工作液浓度对本专利技术检测方法△F的影响结果；图3所示不同避光反应温度对本专利技术检测方法△F的影响结果；图4所示不同避光反应时间对本专利技术检测方法△F的影响结果；图5所示不同甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液的pH值对本专利技术检测方法△F的影响结果；图6所示本专利技术检测方法的标准曲线；图7所示潜在干扰物质对本专利技术香菇多糖测定的影响结果；图8所示DMSO对本专利技术香菇多糖测定的影响结果；图9所示现有专利CN107132149A方法的标准曲线；图10所示潜在干扰物之对现有专利CN107132149A方法对香菇多糖测定的影响。具体实施方式本专利技术公开了一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术所述检测方法已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述检测方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。以下就本专利技术所提供的一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法做进一步说明。实施例1：不同激发波长和发射波长对本专利技术检测方法△F的影响香菇多糖标准品溶液：取香菇多糖标准品约0.01g，精密称定，溶于0.5mol/LNaOH溶液12.8mL，加入0.2mol/L甘氨酸50mL，用双蒸水定容至100mL，得到100μg/mL香菇多糖标准品溶液，4℃保存；苯胺蓝工作液：取苯胺蓝约0.1g，精密称定，溶于pH100.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，定容至100mL，得到0.1％苯胺蓝工作液。在实验过程中，根据不同波长下的△F变化检测激发波长和发射波长的影响程度。取0.1％苯胺蓝工作液0.4mL和香菇多糖标准品溶液50μL，以pH100.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液定容至1mL，80℃避光反应15min，冷却至室温，进行荧光光谱扫描。结果如表1-2和图1所示，其中F表示实验组荧光强度，即标准品或待测样品溶液反应后荧光强度，F0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法，其特征在于，包括：步骤1、配制不同浓度三螺旋结构香菇多糖标准品溶液，加入苯胺蓝和甘氨酸‑氢氧化钠缓冲溶液组成的苯胺蓝工作液避光反应，在激发波长370‑430nm，发射波长460‑550nm条件下，测定△F，以△F和三螺旋结构香菇多糖标准品溶液浓度为坐标轴，建立标准曲线；步骤2、将待测样品加入步骤1所述苯胺蓝工作液避光反应，在激发波长370‑430nm，发射波长460‑550nm条件下，测定△F，根据所述标准曲线获得待测样品中三螺旋结构香菇多糖的含量。

【技术特征摘要】
1.一种三螺旋结构香菇多糖的快速检测方法，其特征在于，包括：步骤1、配制不同浓度三螺旋结构香菇多糖标准品溶液，加入苯胺蓝和甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液组成的苯胺蓝工作液避光反应，在激发波长370-430nm，发射波长460-550nm条件下，测定△F，以△F和三螺旋结构香菇多糖标准品溶液浓度为坐标轴，建立标准曲线；步骤2、将待测样品加入步骤1所述苯胺蓝工作液避光反应，在激发波长370-430nm，发射波长460-550nm条件下，测定△F，根据所述标准曲线获得待测样品中三螺旋结构香菇多糖的含量。2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述激发波长为390-420nm。3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：范罗嫡，胡明华，田蒋为，郑彦懿，马方励，
申请(专利权)人：无限极中国有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44