特异性人源基因片段及检测其的引物、探针和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性人源基因片段及检测其的引物、探针和应用，具体公开了从人源特异性基因片段的筛选，到特异性引物探针的设计合成与验证，再到标准质粒的构建和精确相对分子质量的获得，标准曲线的绘制以及最后的qPCR定量检测。因此，本发明专利技术最大特点在于探针与引物以其极强的特异性，可对混有其他动物来源的样品进行人源细胞的定性乃至定量检测；也是已知的首次将T5载体用于标准质粒的构建，既能节省时间又可降低成本；同时，该方法在多步骤进行了优化，使得检测更加精确且灵敏。

【技术实现步骤摘要】
特异性人源基因片段及检测其的引物、探针和应用
本专利技术属于药代动力学的生物检测
，特别涉及一种特异性人源基因片段及其引物、探针和应用。
技术介绍
PCR技术自1985年正式诞生以来，很快便得到了生命科学界的普遍认同。经过几十年的不断改进，PCR方法从一种定性的分析方法发展到定量检测，从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，已然成为遗传与分子生物学的根本性基石。在众多技术中，当属1996年问世的实时荧光定量PCR(qPCR)技术应用最为广泛，是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，被美国FDA承认并推崇。qPCR的模板定量有两种策略，即相对定量与绝对定量。相对定量通常采用在PCR反应体系中加入过量SYBR荧光染料，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，因此又称为SYBRGreenI法；绝对定量通常利用TaqMan探针，使每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步，故又称为TaqMan探针法；同时，由于绝对定量需要结合标准质粒绘制的标准曲线进行定量，因此是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比SYBRGreenI法，是一种准确和值得信赖的科学方法。利用标准曲线的qPCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛应用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体监测等诸多领域。近年来，随着生命医学领域的研究逐渐深入，将(干)细胞应用于临床前的研究越来越多，但相应的检测技术并未完全跟上研究的需求。针对将人源(干)细胞移植入实验动物体内进行临床前的治疗研究，对于移植后的细胞在实验动物体内的残留及归巢情况尚无精准可靠的检测手段。现有的检测系统主要存在着下述缺陷：一、标准质粒构建流程繁琐：一般均需要中间质粒进行扩增，或者克隆后需要酶切回收才能连接目的载体；二、标准质粒构建效率不够高：通过靶序列与目的载体连接构建的标准质粒经常有较高的非特异性连接产物；三、对于标准质粒的摩尔分子量计算不够精准：通常利用所构质粒碱基数乘以ATCG四种碱基的平均分子量估算而来；四、标准曲线的绘制不够精确：对于标准质粒的稀释倍数不够，绘制标准曲线所用标准品偏少(一般只有5个左右)；五、经常选用的人源特异基因ALU为多拷贝，且在不同部位的拷贝数略有不同，不能很好的与细胞量对应；同时，由于ALU多拷贝序列较短，不适宜设计相应的引物探针，难以运用qPCR进行绝对定量。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于找到一段人源特异的基因片段，在此基础上设计出特异性的引物与探针，使其能够在混有其他动物细胞的样品中特异性的定量检测出人源细胞。本专利技术的第二个目的在于寻求一种更加简便高效的标准质粒构建方法，为绝对定量时精准快捷地绘制标准曲线奠定基础。本专利技术的第三个目的是在上述两个主要目的的基础上，通过对多个步骤进行优化，使其灵敏度高，特异性好且可重复，最终形成一种可用于特异性定量检测人源基因组片段的系统性方法，实现2017年12月发布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行)》文件中对药代动力学的检测技术。本专利技术的技术方案如下：本专利技术首先在NCBI网站Genome下载获取某个基因在基因组上的全长序列，然后利用NCBI网站上BLAST功能与常用实验动物的基因序列分析比对，获得人源特异性较高的基因片段；其次，利用软件Premierprimer5在人源特异的基因片段中设计特异的引物与探针，包含两端引物及其间的碱基序列即为后期检测的靶序列(目的片段)；待设计好的引物探针经合成验证理想后，即可将目的片段克隆出来、跑胶回收并连接到目的载体上构建成标准质粒；再次，利用测序无误的标准质粒绘制标准曲线，初测检测限及灵敏度是否达标；最后，将qPCR仪器检测获得的待测样品的CT值代入标准曲线，即可换算出待测样品中人源细胞(基因片段)的含量。至此，除个别步骤需要优化外，用于特异性定量检测人源细胞基因片段的系统性方法已基本完成。一种特异性人源基因片段，所述的基因片段包括SEQIDNO.1所示的碱基序列。本专利技术还公开了一种特异性检测上述的人源基因片段的引物、探针。优选为，所述的引物包括SEQIDNO.2所示的Primer-F的碱基序列和SEQIDNO.3所示的Primer-R的碱基序列，所述的探针包含SEQIDNO.4所示的Probe的碱基序列。因此，针对含有其他动物细胞的混合样品，SEQIDNO.1&2所示引物既可对其进行是否含有人源细胞的定性分析，也可借助如SEQIDNO.3所示特异性探针对其含有的人源细胞进行定量检测。本专利技术还公开了一种利用上述的人源基因片段或上述引物构建的标准质粒。优选为，所述的标准质粒为将上述的人源基因片段直接连接到全式金公司E-Bluntzero载体上。优选为，所述的标准质粒为利用上述引物克隆得到包括SEQIDNO.1所示的碱基序列，再直接连接到全式金公司E-Bluntzero载体上。其中，E-Bluntzero(T5)载体作为已知具体碱基序列的无须酶切的目的载体。本专利技术还公开了一种定量检测待测样品所含人源基因片段含量的方法，包括以下步骤：(1)获得上述标准质粒的精确相对分子质量，将标准质粒按照拷贝数从10^10逐级10倍稀释至10^0，获得11个标准样，然后利用该标准样绘制标准曲线；(2)用qPCR定量检测待测样品，将检测得到的数据代入标准曲线中，即得到待测样品所含人源基因片段的含量。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：通过实验验证，本专利技术的一种用于特异性定量检测人源基因组片段的系统性方法，具有高特异性，强灵敏度，重复性好，精确度高等优点，最大的特点在于极特异的引物探针既可定性也可以定量检测人源细胞的含量，且是第一个已知的将商品化E-Bluntzero(T5)载体应用于简单高效的标准质粒构建中，既能节省时间也可降低成本，该方法在多步骤进行了优化，使得检测更加精确且灵敏；同时，通过精确计算标准质粒的相对分子质量与标准样的拷贝数，最终达到了最低检测限在10^1时，标准曲线的R^2＝0.9994的极佳检测效果。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。附图说明图1为实施例1候选基因在基因组上的全长序列检索示意图；图2为实施例1候选基因在不同物种中的序列差异比对示意图；图3为实施例1选取人源特异性较高的基因片段示意图；图4为实施例2理论分析引物与探针特异性时输入示意图；图5为实施例2理论分析引物与探针特异性时勾选不同属性示意图；图6为实施例2理论分析引物特异性所得检索结果示意图；图7为实施例2理论分析探针特异性所得检索结果示意图；图8为实施例2检测引物、探针的溶解曲线示意图；图9为实施例2检测引物、探针特异性的验证结果示意图；图10为实施例3精准计算标准质粒相对分子质量的示意图；图11为实施例3特异性定量检测人源基因组片段时的标准曲线示意图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应该理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限定本专利技术的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本专利技术做出的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。实施例1特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性人源基因片段，其特征在于，所述的基因片段包括SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种特异性人源基因片段，其特征在于，所述的基因片段包括SEQIDNO.1所示的碱基序列。2.一种特异性检测权利要求1所述的人源基因片段的引物、探针。3.根据权利要求2所述的引物、探针，其特征在于，所述的引物包括SEQIDNO.2所示的Primer-F的碱基序列和SEQIDNO.3所示的Primer-R的碱基序列，所述的探针包含SEQIDNO.4所示的Probe的碱基序列。4.一种利用权利要求1所述的人源基因片段或权利要求2～3任一项所述的引物构建的标准质粒。5.根据权利要求4所述的标准质粒，其特征在于，将权利要求1所述的人源基因片段直接连接到全式金...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶石成，王皓，钟熊，齐念民，
申请(专利权)人：上海丽坤生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31