猪瘟兔化弱毒表位突变株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及猪瘟兔化弱毒株表位突变株及其应用。本发明专利技术构建的猪瘟兔化弱毒株表位突变株，不仅保持了猪瘟兔化弱毒株安全性好，免疫原性优良等特点，而且该毒株稳定性好，细胞生产病毒含量高，能用于工业化大生产，免疫猪体后产生的抗体可区分免疫和自然感染，在猪瘟净化过程中或暴发疫情时免疫，根据是否存在免疫抗体，有选择的屠杀感染田间毒的动物，可降低经济损失，有利于猪瘟的净化根除及紧急免疫，对防控净化猪瘟及紧急免疫都具有重大意义。

The weak epitope mutant of swine fever rabbit and its application

The present invention relates to the epitope of the weakly virulent strain of the swine fever rabbit and its application. The invention of hog cholera Lapinised virus epitope mutant, not only to maintain the safety of hog cholera Lapinised virus, immune and other excellent characteristics of the original, and the strain has good stability, high content of virus producing cells, can be used for industrial production, produced after the pig immune antibody can distinguish immune and natural infection in the purification process, swine fever outbreak or immune, based on the presence of antibodies, selectively killing virus infection in field of animal, can reduce the economic losses, purification and eradication of swine fever for emergency immunization, is of great significance to the prevention and control of swine plague purification and emergency immunization.

【技术实现步骤摘要】
猪瘟兔化弱毒表位突变株及其应用
本专利技术涉及猪瘟兔化弱毒表位突变株及其应用，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
一直以来，猪瘟是猪的最重要传染病之一，发病率高，死亡率高，一旦暴发往往引起巨大的经济损失，OIE将其列为法定通报疫病，我国将其归类为一类动物传染病。欧美等发达国家在经过几十年的免疫控制后，已逐渐消灭了猪瘟，但在部分发展中国家使用疫苗免疫，仍然出现非典型、温和型猪瘟，以及持续感染、隐性感染等现象。在这些国家，淘汰感染猪只、净化猪群是当务之急。我国用猪瘟兔化弱毒株(又称C株)生产的猪瘟活疫苗以其良好的安全性、免疫原性以及坚强免疫力被全世界广泛应用，为猪瘟疫苗的“金标准”，但该毒株免疫后不能区分免疫与自然感染动物(differentiationofinfectedfromvaccinatedanimals，DIVA)，因此净化猪瘟时使用该疫苗很难通过测定抗体筛出感染猪。此外，猪瘟在非免无疫区暴发时将造成巨大的经济损失，如欧洲1997/1998年发生的猪瘟。当猪瘟暴发时采取扑杀及紧急免疫措施有利于控制疫情，出于经济和动物福利考虑，紧急免疫接种标记疫苗具有重要的经济效益和社会效益。鉴于以上原因，猪瘟标记疫苗一直是近些年的研究热点，按照文献报道，可将标记疫苗分为阳性标记、阴性标记和双标记疫苗(Dong,X.N.,Chen,Y.H.,2007.MarkervaccinestrategiesandcandidateCSFVmarkervaccines.Vaccine25,205-230.)。阳性标记疫苗通常引入外源基因，可判断动物是否免疫。表位突变毒株通常缺失部分中和表位或蛋白，可通过检测针对缺失表位或蛋白产生的抗体区分免疫与自然感染动物。双标记疫苗通常含有上述两种标记，便于更好的区分免疫与感染动物。亚单位疫苗、活载体疫苗、反向遗传修饰疫苗、DNA疫苗等均可以归为标记疫苗。其中E2亚单位疫苗是最早开发的猪瘟标记疫苗，如Pesti及但欧盟猪瘟参考实验室对这两种疫苗进行猪体免疫攻毒及阻止水平传播等进行了评估，发现E2亚单位疫苗与经典C株疫苗相比，抗体产生时间较晚，免疫保护力不够坚强，免疫攻毒后不能阻止水平传播等，建议不作为紧急免疫用疫苗。活载体疫苗是以其它病毒为载体，插入猪瘟病毒的主要免疫抗原基因而获得，如腺病毒、伪狂犬病毒等，近期以BVDV为载体的CP7_E2Alf疫苗已在欧洲通过注册，该毒株(CP7_E2Alf)将BVDVE2替换为猪瘟E2基因，该疫苗属于表位突变毒株，在野猪口服免疫中取得了良好效果(Koenig,P.,Lange,E.,Reimann,I.,Beer,M.,2007.CP7_E2alf:asafeandefficientmarkervaccinestrainfororalimmunisationofwildboaragainstClassicalswinefevervirus(CSFV).Vaccine25,3391-3399.)。2009年L.G.Holinka等以猪瘟病毒Brescia株为基础研究开发了双标记疫苗，插入外源片段Flag并突变E2蛋白表位，获得了较好的免疫攻毒结果(Holinka,L.G.,Fernandez-Sainz,I.,O'Donnell,V.,Prarat,M.V.,Gladue,D.P.,Lu,Z.,Risatti,G.R.,Borca,M.V.,2009.Developmentofaliveattenuatedantigenicmarkerclassicalswinefevervaccine.Virology384,106-113)，但该疫苗以强毒株为基础，毒力返强的可能性较高，并且其免疫谱未知，是否具有我国C株的普遍适用性也不得而知。
技术实现思路
本专利技术的目的在于以猪瘟病毒C株全长感染性克隆为基础，将E2基因中的某一表位进行突变或缺失，经病毒拯救获得猪瘟兔化弱毒株的表位突变毒株。该毒株病毒遗传稳定性良好，即保持着C株优秀的安全性、免疫原性等特点，制备的疫苗免疫动物后攻毒保护效果良好，还能通过检测相应表位的抗体，用于区分免疫动物与自然感染动物。本专利技术技术方案1.一种猪瘟兔化弱毒表位突变株，其特征在于该毒株是通过以猪瘟病毒C株全长感染性克隆为基础，将其E2基因中的某一表位进行突变或缺失，经病毒拯救而获得的一株猪瘟C株的表位突变毒株，被命名为猪瘟病毒(Hogcholeravirus)猪瘟兔化弱毒表位突变株(mHCLV-ZJS，简称mHCLV),该毒株于2017年11月3日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.12377。2.如本专利技术所述一种猪瘟兔化弱毒表位突变株，其特征在于该突变株病毒E2蛋白的氨基酸序列与C株相比，至少含有以下一种氨基酸替换或缺失：第774位替换为Asn，第830位替换为Ser，第831位替换为Phe或Gly，第832位替换为Gly，第833位替换为Met或缺失，第834位替换为Asp或缺失；优选为含有第774位替换为Asn，第830位替换为Ser，第831位替换为Phe或Gly，第832位替换为Gly，第833位替换为Met，第834位替换为Asp。3.如本专利技术所述一种猪瘟兔化弱毒株表位突变株，其特征在于该突变株病毒E2基因核苷酸序列与C株相比，有以下一种或多种替换：第2694-2696位核苷酸替换为序列1，第2862-2876位核苷酸替换为序列2，第2865-2876位核苷酸替换为序列3，第2865-2876位核苷酸替换为序列4；优选为第2862-2876位核苷酸替换为序列2。4.如本专利技术所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株，其特征在于该毒株其E2蛋白中TAVSPTT表位氨基酸序列与C株相比，替换为序列6或/和序列7或/和序列8，优选为TAVSPTT表位氨基酸序列替换为序列6。5.如本专利技术所述的猪瘟兔化弱毒表位突变株的构建，其特征在于可通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、测序、过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接免疫荧光染色(IFA)来区分猪瘟病毒C株表位突变毒株与猪瘟病毒C株及猪瘟病毒野毒株。6.本专利技术所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株的应用，其特征在于该毒株可作为生产毒株制备猪瘟活疫苗。7.本专利技术所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株的应用，其特征在于该株病毒制备的疫苗免疫猪体后，可通过检测针对氨基酸序列5的血清学抗体来区分疫苗免疫与野毒感染动物，免疫猪不产生针对序列5的抗体，野毒感染猪可产生针对序列5的抗体。8.本专利技术所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株的应用，其特征在于可通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来区分免疫抗体与自然感染抗体。本专利技术具体实施方式1.猪瘟兔化弱毒表位突变毒株的构建本专利技术猪瘟兔化弱毒表位突变毒株基于反向遗传操作技术，以猪瘟病毒C株全长感染性克隆为基础，通过基因突变或缺失，将E2基因中重要表位的关键氨基酸替换或缺失而获得。具体是通过以下技术方案实现的(见图1)：(1)目的序列扩增：通过重叠PCR将替换或缺失的编码序列引入，分别用序列9和序列10扩增引入替换序列2，序列11和序列12引入替换序列3，序列13和序列14引入序列4。(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪瘟兔化弱毒株表位突变株，其特征在于该毒株是通过以猪瘟病毒C株全长感染性克隆为基础，将其E2基因中的某一表位进行突变或缺失，经病毒拯救而获得的一株猪瘟C株的表位突变毒株，被命名为猪瘟病毒(Hog cholera virus)猪瘟兔化弱毒表位突变株(mHCLV‑ZJS，简称mHCLV),该毒株于2017年11月3日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.12377。

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟兔化弱毒株表位突变株，其特征在于该毒株是通过以猪瘟病毒C株全长感染性克隆为基础，将其E2基因中的某一表位进行突变或缺失，经病毒拯救而获得的一株猪瘟C株的表位突变毒株，被命名为猪瘟病毒(Hogcholeravirus)猪瘟兔化弱毒表位突变株(mHCLV-ZJS，简称mHCLV),该毒株于2017年11月3日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.12377。2.如权利要求1所述一种猪瘟兔化弱毒株表位突变株，其特征在于该突变株病毒E2蛋白的氨基酸序列与C株相比至少含有以下一种氨基酸替换或缺失：第774位替换为Asn，第830位替换为Ser，第831位替换为Phe或Gly，第832位替换为Gly，第833位替换为Met或缺失，第834位替换为Asp或缺失；优选为含有第774位替换为Asn，第830位替换为Ser，第831位替换为Phe或Gly，第832位替换为Gly，第833位替换为Met，第834位替换为Asp。3.如权利要求1-2所述一种猪瘟兔化弱毒株表位突变株，其特征在于该突变株病毒E2基因核苷酸序列与C株相比有以下一种或多种替换：第2694-2696位核苷酸替换...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵启祖，邹兴启，朱元源，李明，王琴，徐璐，李翠，张乾义，徐嫄，万建青，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11