伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株及其应用制造技术

本发明专利技术提供伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株及其应用，属于动物医学的疫苗领域。伪狂犬病病毒LA1206‑80株，保藏编号为：CGMCC No.14329。本发明专利技术还提供伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株在制备伪狂犬病疫苗中的应用、一种重组载体活疫苗。该重组载体是在所述弱毒株基因组中插入了外源保护性抗原基因表达盒后得到的。PRV LA1206‑80株的活疫苗对1日龄初生仔猪100%安全，可用于初生仔猪的早期免疫，尽早阻断野毒的感染。接种断奶PRV阴性仔猪后能快速产生高效保护力，尤其是该疫苗不但能阻止发病，还能阻止排毒。通过对PRV gE和gB抗体进行监测，非常有利于对PRV变异株的净化。

Pseudorabies virus double gene deletion weak strain and its application

The invention provides a pseudorabies virus double gene deletion weak strain and its application, which belongs to the field of the vaccine of animal medicine. Pseudorabies virus LA1206 80 strains, a preservation number of CGMCC No.14329. The invention also provides the application of the pseudorabies virus double gene deletion weak strain in preparing the Pseudorabies Vaccine, and a recombinant vector live vaccine. The recombinant vector is obtained by inserting a foreign protective antigen gene expression box in the genome of the weak strain. PRV LA1206 live vaccine strain 80 to 1 day old piglets 100% safe, can be used for early immunization of newborn piglets, interdict wild virus infection. After inoculation of weanling PRV negative piglets, it can produce high effective protective power, especially the vaccine not only prevents disease, but also prevents detoxification. Through the monitoring of PRV gE and gB antibody, is very conducive to the purification of PRV mutant.

【技术实现步骤摘要】
伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株及其应用
本专利技术属于动物医学的疫苗领域，具体涉及伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株及其应用。
技术介绍
伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(PseudorabiesVirus，PRV)引起的一种急性、烈性传染病。牛、羊等家畜和野生动物发生伪狂犬病时常表现为奇痒的典型症状，以及发热和脑脊髓炎等临床症状。而猪发生伪狂犬病的症状与年龄相关，母猪常发生流产；新生仔猪有神经症状，死亡率高；育肥猪主要是呼吸道症状，成年猪感染伪狂犬病毒后生长停滞，通常不发生死亡。由于PRV基因缺失株疫苗(如gE基因缺失的BarthaK61株等)的专利技术和大规模推广使用，并配合鉴别免疫猪与野毒感染猪的PRVgE抗体的ELISA检测方法的建立和应用，通过持续淘汰阳性种猪，世界上许多国家实现了在家养猪群中伪狂犬病病毒的净化，在我国，许多猪场也成功建立了PRVgE抗体阴性的猪群，不少猪场基本实现了PRV的净化，猪伪狂犬病得到了较好控制。自2011年以来，我国北方许多免疫过传统猪伪狂犬病疫苗的猪场大规模出现猪伪狂犬病疫情，之后疫情迅速向全国大部分养猪场蔓延，PRVgE抗体阳性率居高不下，对我国养猪业造成严重危害。多个团队的研究结果证明此轮疫情是由变异的PRV野毒株引起，该变异株的致病性显著增强，其主要抗原基因与传统疫苗株有明显不同，为更有效地应对PRV变异株的危害，应用变异株研制既能提高保护力，又能鉴别诊断免疫猪与野毒感染猪的新型疫苗是当前我国猪伪狂犬病防控的关键。但是，现有变异株活疫苗的安全性还不够高。例如，申请号为201510388390.9的专利技术专利中公开了通过敲除伪狂犬病病毒野毒AH02LA株gE基因后获得的LA-A株，采用该毒株制备的疫苗对伪狂犬病病毒变异株100％保护效果，尤其是该疫苗不但能阻止发病，还能阻止排毒，但是，该毒株仅对4周龄仔猪安全。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株，该毒株能够很好的适应ST细胞，滴度高，毒力显著降低，对1日龄仔猪无致病性，因此是具有较高安全性的疫苗候选弱毒株。伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株，是伪狂犬病病毒LA1206-80株，保藏编号为：CGMCCNo.14329。本专利技术的另一目的是提供伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株在制备伪狂犬病疫苗中的应用，采用该疫苗免疫后能够对免疫猪只提供100％保护，不但能阻止发病，还能阻止排毒，由于该毒株毒力显著降低，对1日龄仔猪无致病性，因此可用于初生仔猪的早期免疫，尽早阻断野毒的感染，该活疫苗具有较高的安全性。本专利技术的再一目的是提供以伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株为活性成分的疫苗。采用伪狂犬病病毒LA1206-80株的疫苗对1日龄初生仔猪安全，接种断奶PRV阴性易感仔猪后7天即能达到对伪狂犬病病毒变异株100％保护效果，尤其是该疫苗不但能阻止发病，还能阻止排毒，在安全性和免疫效力上都取得了意想不到的技术效果。通过对抗体进行监测，可以区分免疫该疫苗的动物与感染动物，有利于对PRV变异株的净化。本专利技术还提供一种重组载体活疫苗，其活性成分是所述伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株基因组中插入了外源保护性抗原基因表达盒后得到的。启动子可以选择pMCMVIE、SV40和pHCMVIE等，外源基因的插入位点包括基因组的UL22与UL21之间、UL46与UL27之间、UL51与UL50之间、UL35与UL36之间、UL40与UL41之间、UL44与UL26.5之间和UL4与UL3.5之间的非编码区，插入的外源基因包括猪瘟病毒的E蛋白基因、猪圆环病毒的Cap蛋白基因、狂犬病病毒的G蛋白基因、口蹄疫病毒的VP1基因、猪流感病毒的HA基因和兔瘟病毒的VP60基因等。本专利技术活疫苗，是以伪狂犬病病毒LA1206-80株为活性成分，疫苗内可以加入免疫佐剂与疫苗赋形剂等，本领域技术人员可以容易地进行生产。申请人通过大量富有创造性的劳动，获得了一株伪狂犬病病毒基因缺失弱毒株，即PRVLA1206-80株。LA1206-80株gC和gD基因与AH02LA株完全一致(gC基因GenBank:KR605320；gD基因GenBank:KR605321)，均与现公开变异毒株高度同源。本专利技术伪狂犬病病毒LA1206-80株是首先将PRVAH02LA株gE基因(GenBank:KR605321)第13～1298位碱基敲除，再继续敲除TK基因(SEQIDNo:1)第184～530位碱基，然后经细胞传代致弱后克隆筛选而得。伪狂犬病病毒LA1206-80株能够很好地适应ST细胞，生长滴度高达108.5TCID50/mL。伪狂犬病病毒LA1206株的活疫苗对1日龄初生仔猪100％安全，可用于初生仔猪的早期免疫，尽早阻断野毒的感染。接种断奶PRV阴性仔猪后能快速产生高效保护力，对伪狂犬病病毒变异株100％保护，尤其是该疫苗不但能阻止发病，还能阻止排毒，取得了意想不到的技术效果。通过对PRVgE和gB抗体进行监测，可以区分免疫该疫苗的动物与感染动物，非常有利于对PRV变异株的净化。将其用作活载体表达猪易感病原的保护性抗原，还能达到接种一针防两种或多种疫病的效果。附图说明图1、转移载体pPRV(AH02LA)-GFP(gE-)的结构图。图2、转移载体pPRV(AH02LA)-gEΔ的结构图。图3、伪狂犬病病毒PRVAH02LA(ΔgE)株构建示意图。(A)所示为PRVAH02LA株的基因组，UL指独特长区，Us指独特短区，IR和TR分别指内部和未端重复区。(B)所示为通过上游同源臂ΔgE-H1和下游同源臂ΔgE-H2进行同源重组将GFP表达盒替换掉gE基因的部分序列。(C)所示为再次通过同源重组将GFP表达盒敲除，获得缺失gE基因第13～1298位共1286bp核苷酸的PRVAH02LA(ΔgE)株。图4、转移载体pPRV(AH02LA)-GFP(TK-)的结构图。图5、转移载体pPRV(AH02LA)-TKΔ的结构图。图6、伪狂犬病病毒LA1206株构建示意图。(A)所示为PRVAH02LA(ΔgE)株的基因组，UL指独特长区，Us指独特短区，IR和TR分别指内部和末端重复区。(B)所示为通过上游同源臂ΔTK-H1和下游同源臂ΔTK-H2进行同源重组将GFP表达盒替换掉TK基因的部分序列。(C)所示为再次通过同源重组将GFP表达盒敲除，获得缺失gE基因第13～1298位共1286bp核苷酸和TK基因第184位至530位共347bp核苷酸的LA1206株。图7、LA1206-80株和亲本病毒的体外生长特性比较。A：感染ST细胞后感染细胞上清液中病毒的滴度；B：感染ST细胞后细胞结合性病毒的病毒滴度。具体实施方式以下通过具体实施例进一步说明本专利技术，但本专利技术的范围和精神并不限于所列实施例。实施例一、伪狂犬病病毒gE基因缺失株的构建与鉴定1、转移载体的获得为敲除伪狂犬病病毒PRVAH02LA株的部分gE基因，人工合成了由gE基因上游同源臂ΔgE-H1、绿色荧光蛋白表达盒和gE基因下游同源臂ΔgE-H2组成的基因片段，然后将该片段克隆到pUC57载体(南京金斯瑞生物科技有限公司)，得到GFP转移载体pPRV(AH02LA)-GFP(gE-)，其结构如图1所示。gE基因上游同源臂ΔgE-H1的序列如本文档来自技高网...

【技术保护点】
伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株，是伪狂犬病病毒LA1206‑80株，保藏编号为：CGMCC No.14329。

【技术特征摘要】
1.伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株，是伪狂犬病病毒LA1206-80株，保藏编号为：CGMCCNo.14329。2.权利要求1所述伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株在制备伪狂犬病疫苗中的应用。3.以权利要求1所述伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株为活性成分的疫苗。4.根据权利要求3所述疫苗，其特征在于伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株的病毒液采用如下方法制备：将伪狂犬病病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继春，宋增财，郭容利，乔永峰，王志胜，许梦微，刘娅梅，郑亚婷，范红杰，侯继波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32