本发明专利技术涉及生物工程产品的生产及应用技术领域，具体涉及一种重组人甲３型流感病毒基质蛋白以及该蛋白的生产方法及应用领域。本发明专利技术通过对人甲３型流感病毒Ｍ１蛋白抗原性的分析，选取抗原性较高的区域运用分子生物学方法进行抗原基因片段的体外重组并制备抗原基因片段对应的抗原蛋白，从而制备相应的抗体，解决了目前临床对甲型流感病毒感染不能早期、快速诊断的缺点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程产品的生产及应用的
，具体涉及一种重组人甲3型流感病毒基质蛋白(matrix protein，M1)以及该基质蛋白的生产方法及其应用
技术介绍
流感病毒感染至今仍未得到很好的控制，仍然是引起人类死亡的主要病因之一。流行性感冒病毒(influenzavirus，IFV)，简称流感病毒，属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，根据病毒核蛋白(nucleoprotein，NP)和基质蛋白抗原性不同，分为甲、乙、丙3型；甲型流感病毒易发生变异，形成新的亚型，如甲1、甲3型。甲型流感病毒是反复流行最为频繁和引起流感全球流行的重要病原体。基质蛋白(M1蛋白)位于病毒脂质包膜下面，并与膜结合的蛋白。基质蛋白是由病毒RNA第7片段编码的，是病毒颗粒的主要结构蛋白，其大小为252个氨基酸残基。X线分析M蛋白晶体结构显示，M蛋白2-158氨基酸残基片段包含9个α-螺旋(H1-9)，8个环(L1-8)，没有β-片层(β-strand)。文献报道，重组表达M蛋白可用于检测感染患者体内流感病毒特异性的抗体；并且，Westernblot检测显示，体外重组表达的M蛋白，能够与针对M蛋白的表位特异(epitope-specific)单克隆抗体发生特异性反应。M1蛋白是流感病毒的主要抗原性蛋白之一，并且在型内具有很高的同源性，可以作为流感病毒病原学快速诊断的靶位点。目前，临床通用的流感病毒诊断试剂，血清学诊断(如特异性IgG、IgA检测，血凝素抑制试验、补体固定试验等)、基因诊断、病原学诊断等。血清学诊断基于感染患者体内特异性IgG或IgA的出现，不容易在病毒感染早期进行检测；并且，血凝素抑制试验由于血凝素抗原易于变异的特点而需要适时调整病毒抗原的制备。临床上通用的流感病毒诊断试剂是针对流感病毒感染患者体内病毒特异性抗体，而病毒特异性抗体产生一般在发病两周后，此时即使检测出对临床的诊断治疗贡献不是很大。亦有用流感病毒特异的单克隆抗体检测呼吸道感染标本中的病毒抗原，但这种抗体来源于从病毒感染细胞中制备的抗原所诱导产生，劳动成本大，并且受单克隆抗体针对唯一抗原位点的局限性，以及流感病毒的高变异性，容易造成假阴性。临床上对流感病毒感染的早期、快速诊断显得极为迫切。基于人甲3型流感病毒M1蛋白抗原性预测分析，体外重组抗原片段并制备高效价抗体的生产工艺较传统病毒抗原获得、抗体制备有大量的优点，具有良好的应用前景，可以用于流感病毒抗原的快速检测。
技术实现思路
针对市场上现有的试剂不能高效、快速诊断的缺点，本专利技术人对流感病毒M1蛋白的核苷酸序列进行了分析，专利技术了高效、快速诊断流感疾病的抗体和其对应的抗原。本专利技术第一个目的在于公开了编码重组人甲3型流感病毒M1蛋白抗原蛋白的基因序列及其编码的抗原蛋白序列。本专利技术第二个目的在于公开了重组M1蛋白抗原的制备方法及其对应抗体的制备方法及其应用。为了达到以上目的，本专利技术人采用了以下技术方案1、M蛋白的抗原性预测分析用ClustalX(国家生物技术信息中心)、DNAsis(日本日立软件公司研发)软件，对来源不同的甲型流感病毒以及乙型流感病毒M1蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列的亚型间、型间同源性。比较分析发现，甲型流感病毒(A1、A3)内各亚型病毒M1蛋白的氨基酸序列同源性较高，约在95％以上，而甲、乙型之间序列同源性较低，约为30％。经Antheprot软件(法国蛋白质生物学和化学研究所研发)，进行M1蛋白的抗原性预测分析发现，在M1蛋白的N、C端分别有多个抗原性高峰分布区，中间区域(氨基酸残基110-145)为α-螺旋跨膜区。文献报道显示，在M1蛋白存在抗原性位点，57-68氨基酸残基区域是细胞毒T细胞的抗原表位。根据M1蛋白抗原表位分布情况，我们将M1蛋白分为M1P1(4-321碱基对)，M1P2(439-756碱基对)，以及M1全长片段(4-756碱基对)。根据Antheprot软件分析预测，M1蛋白含有如下抗原性位点M1P1(4-321碱基对)含有的高抗原性表位，包括氨基酸残基11-19；66-77；81-92；98-104；抗原表位分布较稀疏、抗原性波峰狭窄。M1P2(439-756碱基对)含有的高抗原性表位，包括氨基酸残基150-160；189-198；218-231；233-242。M1P2含有的抗原性表位较丰富、抗原性波峰高、宽，并且亲水性较高，相应的，疏水性较低，预测显示该抗原片段的抗原性较高。M1蛋白跨膜区位于氨基酸残基57-63；120-133；140-149。我们选择M1P2抗原性片段作为研究的靶位点，并预期有较高的抗原性。2、M1抗原性片段基因的获得2.1引物的设计和合成对Genbank号为M19374的核苷酸序列进行分析，选取M1P2为研究对象，用Primer Premier软件(加拿大Premier生物软件国际公司)设计并合成如下引物(包含BamH I、Xho I限制性内切酶切位点)上游引物，5’cgg gat cct agt atg cgc aac ctg tg 3’下游引物，5’tcc gct cga gct tga atc dtt gca tc 3’2.2RT-PCR反应获得目的基因片断用Trizol从人甲3型流感病毒标准株感染的MDCK细胞中提取病毒RNA，并逆转录为cDNA，以cDNA为模板，通过PCR扩增，获得序列如SEQ ID NO.1所示的目的基因片段。其中逆转录反应体系向9μL RNA加入1μL Oligo dT(40μg/μL)，70℃，5分钟。冷却至室温。追加5×MLV buffer，5μL；10mmol/L dNTP，2.5μL；25mmol/L MgCl2，3.75μL；RNasin，0.5μL；MMLV(200U/μL)，1μL；DEPC-H2O，2.25μL。37℃，水浴，1小时。PCR反应体系10×buffer，5μL；10mmol/L dNTP，1μL；上游引物，1μL；下游引物，1μL；Taq聚合酶，1μL；25mmol/LMgCl2，3μL；DW，37μL；模板，1μL。94℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，1分钟，以上反应30个循环，72℃，5分钟。取6μL反应产物，走1.5％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR扩增结果。3、构建重组pET-28c(+)/IFV.ml原核表达质粒将双限制内切酶BamH I、Xho I切割后的目的基因片段与内切酶BamH I、Xho I切割后的载体pET-28c(+)静置在反应体系中反应12-16小时，制备含有目的基因的重组质粒pET-28c(+)/IFV.ml。具体步骤如下3.1目的基因的酶切步骤将15μL目的基因片断放入2μL Xho I，2μL 10×buffer，37℃的反应体系中，静置反应12-16小时后，在反应体系中加入2μL BamH I，在37℃的温度条件下继续酶切2小时； 3.2pET-28c(+)质粒载体的酶切步骤将6μL pET-28c(+)质粒放入2μL BamH I、2μL Xho I、4μL10×buffer、26μL dH2O、37℃的反应体系中，静置反应2小时；3.3连接子的制备取3μL酶切后的pET-28c(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码重组人甲３型流感病毒抗原蛋白的基因，其核苷酸序列如序列１所述。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：包怡华，辛若雷，钱渊，王芳，张霆，
申请(专利权)人：首都儿科研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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