一种利西拉来的制备方法技术

本发明专利技术涉及多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种利西拉来的制备方法。本发明专利技术根据利西拉来肽的肽序结构，采用特定的保护的丝氨酸二肽作为原料偶联到肽序中，由于形成了类似脯氨酸的环状结构，能有效的防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生。根据实验，本发明专利技术精肽收率可高达25.8％～28.8％，优于顺序逐个偶联方法(约15.4％)。同时，本发明专利技术精肽的纯度为99.3％。在保证了纯度的同时保证了收率。

A preparation method of the lixisenatide

The invention relates to the field of polypeptide synthesis technology, particularly relates to a method for preparing the lixisenatide. According to the invention of peptide sequence structure lixisenatide peptide, using specific protection of serine two peptide coupled to the peptide sequence as raw materials, due to the formation of a cyclic structure similar to proline, can effectively prevent the peptide bond rotation, inhibitory peptide agent crimp contraction, the active functional groups (amine) fully exposed, which is conducive to the coupling of amino acids and reduce the occurrence of defects and other side reactions. According to the experiment, the yield of the refined peptide can reach 25.8% to 28.8%, which is better than that of the order one by one coupling method (about 15.4%). At the same time, the purity of the refined peptide is 99.3%. The yield is guaranteed while the purity is guaranteed.

【技术实现步骤摘要】
一种利西拉来的制备方法
本专利技术涉及多肽药物合成
，尤其涉及一种利西拉来的制备方法。
技术介绍
利西拉来(Lixisenatide)是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，是基于具降糖活性的GLP-1类似物Exendin-4的C末端6个赖氨酸残基的修饰而合成的新型GLP-1类似物，能耐受体内二肽基肽酶Ⅳ(DPP4)的降解作用。利西拉来的结构如式I所示：其肽序为：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2作为GLP-1类似物的一种，利西拉来适用于服用二甲双胍、磺脲类、噻唑烷二酮类、二甲双胍和磺脲类联用、二甲双胍和噻唑烷二酮类联用的II型糖尿病患者中，不能有效控制血糖的患者的辅助治疗，以改善对血糖的控制。目前一种常规合成利西拉来的方法是固相逐步合成(SPPS)法，该方法具有操作简单、设备要求低等特点。但是因为利西拉来由44个氨基酸组成，固相逐步合成法的产品收率低，肽在合成树脂上容易发生二级结构的弯曲，导致反应位点被包裹，得到的利西拉来粗肽纯度低，杂质繁杂，给产品纯化带来困难，不易得到较高纯度的利西拉来。对于解决偶联困难的氨基酸问题，片段合成法是固相合成方法中一种常用的手段。片段合成法是先将偶联困难的序列制备成全保护肽片段，按照氨基酸序列将其作为整体直接偶联到指定肽树脂上，从而避开偶联困难的氨基酸位点，避免逐个氨基酸偶联产生的缺损等副反应，能够获得纯度相对高的粗肽，降低纯化难度。但片段合成法采用了常规的树脂外，还需使用大量价格较昂贵的2-CTC树脂制备片段肽树脂，且2-CTC树脂酸敏感性高，偶联时肽容易从树脂上脱落，从而导致制备的片段收率不高，操作步骤相对繁琐，生产成本也大幅度提高。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种利西拉来的制备方法，该方法操作简便，总收率高，所得产物纯度较高。本专利技术提供了一种利西拉来的制备方法，包括：步骤1：固相合成Fmoc-Lys-树脂；步骤2：根据利西拉来的肽序在所述Fmoc-Lys-树脂上偶联氨基酸或二肽制得利西拉来肽树脂；所述二肽选自-Gly-Thr、-Phe-Thr、-Thr-Ser、-Leu-Ser、-Ser-Ser或-Pro-Ser；步骤3：所述利西拉来肽树脂经裂解制得利西拉来。本专利技术提供的方法将利西拉来肽序中第4～5位(-Gly-Thr，记为二肽A)、第6～7位(-Phe-Thr，记为二肽B)、第7～8位(-Thr-Ser，记为二肽C)、第10～11位(-Leu-Ser，记为二肽D)、第32～33位(-Ser-Ser，记为二肽E)或第31～32位、第37～37位(-Pro-Ser，记为二肽F)的氨基酸以二肽为原料进行偶联，选用的二肽原料为二肽A～F中任一种或多种，不采用二肽为原料的位点则采用单个氨基酸为原料进行偶联。该方法能够有效防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生。在本专利技术的实施例中，偶联-Gly-Thr采用Fmoc-Gly-Thr(PSIME,MEPro)-OH；偶联-Phe-Thr采用Fmoc-Phe-Thr(PSIME,MEPro)-OH；偶联-Thr-Ser采用Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSIME,MEPro)-OH；偶联-Leu-Ser采用Fmoc-Leu-Ser(PSIME,MEPro)-OH；偶联-Ser-Ser采用Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSIME,MEPro)-OH；偶联-Pro-Ser采用Fmoc-Pro-Ser(PSIME,MEPro)-OH。其中，Fmoc-Gly-Thr(PSIME,MEPro)-OH的结构如式II-a；Fmoc-Phe-Thr(PSIME,MEPro)-OH的结构如式II-b；Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSIME,MEPro)-OH的结构如式II-c；Fmoc-Leu-Ser(PSIME,MEPro)-OH的结构如式II-d；Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSIME,MEPro)-OH的结构如式II-e；Fmoc-Pro-Ser(PSIME,MEPro)-OH的结构如式II-f。在本专利技术中，Fmoc-Lys-树脂的树脂为RinkAmide树脂、RinkAmide-MBHA树脂、RinkAmide-AM树脂或Siber树脂。其中，Lys的保护基为Boc。作为优选，Fmoc-Lys(Boc)-树脂的替代度为0.1mmol/g～0.6mmol/g。优选的，替代度范围为0.2mmol/g～0.4mmol/g。在本专利技术的实施例中，偶联的偶联剂为HOBt与DIC的混合物；其中HOBt与DIC的摩尔比为1:1。在本专利技术中，所述偶联的步骤包括：脱除Fmoc保护后，以DCM和DMF的混合液为溶剂，与偶联剂混合后进行偶联反应。作为优选，脱除保护的树脂与待偶联氨基酸的摩尔比为1:3。重复偶联的步骤直至合成整个肽链。在本专利技术中，偶联反应的条件为室温反应2h。所述室温为10℃～30℃。作为优选，如偶联反应不完全则继续偶联反应1h。在本专利技术中，偶联反应结束后以甲醇收缩，树脂真空干燥过夜。在本专利技术的实施例中，裂解的裂解剂为裂解的裂解剂包括TFA与B组分；所述B组分选自PhSMe、PhOMe、EDT、H2O、TIS或PhOH。作为优选，裂解剂中TFA、PhSMe、PhOMe、EDT、H2O、TIS、PhOH的体积比为(80～90)：(0～5):(0～3):(0～5):(0～5)：(0～2)：(0～5)。优选的，裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS、H2O的体积比为84:5:5:5:1。优选的，裂解剂中TFA、PhSMe、EDT、H2O的体积比为91:3:3:3。优选的，裂解剂中TFA、PhSMe、EDT、PhOMe的体积比为90:5:3:2。优选的，裂解剂中TFA、EDT、H2O的体积比为90:5:5。优选的，裂解剂中TFA、PhSMe、PhOH、EDT、H2O的体积比为85:5:3:5:2。在本专利技术中，裂解的步骤包括：将利西拉来肽树脂与裂解液混合，室温裂解2.5h～3h后，以TFA洗涤树脂、以无水乙醚沉淀，获得利西拉来线性粗肽。作为优选，无水乙醚沉淀的温度为0～4℃。作为优选，利西拉来肽树脂与裂解液的质量-体积比为1:8～15。在本专利技术的实施例中，步骤3后还包括纯化、转盐的步骤。具体的，纯化的色谱采用NOVASEPRP-HPLC系统，检测波长220nm，色谱柱为反相C18柱，流动相A相为体积分数为0.1％的TFA水溶液，流动相B相为乙腈。洗脱梯度为18％乙腈-48％乙腈45min，48％等度15min：纯化后经转盐色谱，转盐。具体的转盐为转化为醋酸盐，盐酸盐，枸橼酸盐，磷酸盐，三氟乙酸盐，钠盐，钾盐或铵盐。在一些实施例中，仅引入二肽A，二肽C、二肽D、二肽E、二肽F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利西拉来的制备方法，其特征在于，包括：步骤1：固相合成Fmoc‑Lys‑树脂；步骤2：根据利西拉来的肽序在所述Fmoc‑Lys‑树脂上偶联氨基酸或二肽制得利西拉来肽树脂；所述二肽选自‑Gly‑Thr、‑Phe‑Thr、‑Thr‑Ser、‑Leu‑Ser、‑Ser‑Ser或‑Pro‑Ser；步骤3：所述利西拉来肽树脂经裂解制得利西拉来。

【技术特征摘要】
1.一种利西拉来的制备方法，其特征在于，包括：步骤1：固相合成Fmoc-Lys-树脂；步骤2：根据利西拉来的肽序在所述Fmoc-Lys-树脂上偶联氨基酸或二肽制得利西拉来肽树脂；所述二肽选自-Gly-Thr、-Phe-Thr、-Thr-Ser、-Leu-Ser、-Ser-Ser或-Pro-Ser；步骤3：所述利西拉来肽树脂经裂解制得利西拉来。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，偶联-Gly-Thr采用Fmoc-Gly-Thr(PSIME,MEPro)-OH；偶联-Phe-Thr采用Fmoc-Phe-Thr(PSIME,MEPro)-OH；偶联-Thr-Ser采用Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSIME,MEPro)-OH；偶联-Leu-Ser采用Fmoc-Leu-Ser(PSIME,MEPro)-OH；偶联-Ser-Ser采用Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSIME,MEPro)-OH；偶联-Pro-Ser采用Fmoc-Pro-Ser(PSIME,MEPro)-OH。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联的偶联剂为HOBt与DIC的混合物；其中HOBt与DIC的摩尔比为1:1。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述裂解的裂解剂包括TFA与B组分；所述B组分选自PhSMe、PhOMe、EDT、H2O、TIS或PhOH。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3后还包括纯化、转盐的步骤。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSIME，MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSIME，MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSIME，MEPro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSIME，MEPro)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSIME，MEPro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSIME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSIME,MEPro)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSIME,MEPro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSIME,MEPro)-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSIME,MEPro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSIME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSIME,MEPro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSIME,MEPro)-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSIME,MEPro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSIME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈新亮，宓鹏程，陶安进，袁建成，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44