胰腺祖细胞的增殖方法技术

本发明专利技术涉及以ES细胞、iPS细胞等多功能性干细胞为来源，诱导分化胰腺祖细胞，并对其进行培养增殖从而制备高纯度的胰腺祖细胞的方法。具体涉及胰腺祖细胞的增殖方法，其包括将胰腺祖细胞用含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的培养基培养的工序。

Methods for the proliferation of pancreatic progenitor cells

The invention relates to a method for inducing differentiation of pancreatic progenitor cells and culturing and proliferating them by using multifunctional stem cells such as ES cells and iPS cells so as to prepare high-purity pancreatic progenitor cells. Specifically, a method for the proliferation of pancreatic progenitor cells, comprising the process of culturing pancreatic progenitor cells with a culture medium containing (I) EGF signaling activators and / or FGF signaling activators and (II) ROCK inhibitors.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】胰腺祖细胞的增殖方法相关申请本申请基于日本专利申请2014-158470号(2014年8月4日提出申请)要求优先权并将其内容通过参考并入本文。
本专利技术涉及胰腺祖细胞(pancreaticprogenitorcell)的增殖方法、以及胰腺祖细胞增殖用试剂和试剂盒。更具体而言，涉及一种包括将胰腺祖细胞用含有EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和ROCK抑制剂的培养基培养为特征的胰腺祖细胞的增殖方法、以及用于上述方法的试剂及试剂盒。
技术介绍
胰脏具有内分泌腺(内分泌细胞)和外分泌腺(外分泌细胞)，由作为内分泌细胞的胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞和PP细胞分别分泌称为胰高血糖素、胰岛素、促生长素抑制素、胰多肽的胰腺激素，而由外分泌细胞分泌消化酶如胰脂肪酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胰淀粉酶等。糖尿病大体分类为I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)和II型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病)这2种，其中，I型糖尿病是由于产生胰岛素的胰腺β细胞的破坏导致胰岛素的分泌受损而发生的。作为近年来尝试的对于I型糖尿病的治疗方法，除了使源自患者的胰腺β细胞再生并进行移植的方法、将由ES细胞或者iPS细胞诱导分化成的胰腺β细胞进行移植的方法以外，还已知有移植胰腺祖细胞而减弱糖尿病的方法。与上述治疗法相关，已有关于内胚层细胞的增殖方法、由得到的内胚层细胞得到β细胞的诱导方法(专利文献1)、由人多功能性干细胞得到增殖性内胚层细胞的诱导方法(非专利文献1)、由人多功能性干细胞得到增殖性前肠内胚层细胞的诱导方法(非专利文献2)的报告。虽然也有关于使由胰腺祖细胞分化而成的胰腺内分泌祖细胞增殖的方法(非专利文献3)的报告，但预计由于将胰腺内分泌祖细胞与间充质细胞进行共培养，因此得到的胰腺内分泌祖细胞的纯度不会非常高。另外，在该报告中对于胰腺祖细胞的增殖方法没有记载。虽然有关于使用人ES细胞的NKX6.1阳性胰腺祖细胞的诱导方法，及利用NKX6.1高表达胰腺祖细胞来治疗糖尿病(非专利文献4)的报告，但对于胰腺祖细胞的增殖方法没有记载。另外，也有对由人ES细胞、人iPS细胞诱导分化胰岛素产生细胞，并移植至小鼠对糖尿病治疗的应用进行研究的报告，但对于胰腺祖细胞的增殖方法没有记载(非专利文献6及7)。从活体分离的胰腺祖细胞经常在传代培养时停止增殖，难以在活体外有效地增殖胰腺祖细胞。Sui等报告了关于将源自ES细胞的胰腺祖细胞用含有B-27(注册商标)补充剂(supplement)、FGF10、EGF、SB431542(TGFβ抑制剂)的DMEM/F12培养基进行增殖的方法(非专利文献5)。但是，该方法的增殖速度为10周约30倍，得到的胰腺祖细胞的纯度为约50％，还不够充分。现有技术文献专利文献专利文献1：US2010/0041150非专利文献非专利文献1：XinChengetal.,CellStemCell10(2012),371-384非专利文献2：Hannanet.al.,StemCellReports1(2013),293-306非专利文献3：Sneddonet.al.,Nature491(2012),765-770非专利文献4：Rezaniaet.al.,StemCells31(2013),2432-2442非专利文献5：LinaSuiet.al.,StemCellRevandRep9(2013),569-577非专利文献6：Rezaniaetal.NatureBiotechnology32(2014),1121-1133非专利文献7：Pagliucaetal.,Cell159(2)(2014),428-439
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的课题在于，使胰腺祖细胞以保持其功能的状态在活体外有效地增殖。尤其是，提供以ES细胞、iPS细胞等多功能性干细胞为来源(source)，诱导分化胰腺祖细胞，对其进行培养和增殖，从而制备高纯度胰腺祖细胞的方法。解决问题的方法专利技术人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：通过将胰腺祖细胞用含有EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和ROCK抑制剂的培养基培养，可高效率地得到高纯度的胰腺祖细胞，进而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及以下[1]～[8]。[1]胰腺祖细胞的增殖方法(在本说明书中，有时简称为本专利技术的增殖方法)，其中，对胰腺祖细胞进行以下工序(1)：(1)用含有(i)EGF信号转导激活因子(EGFsignaltransductionactivator)和/或FGF信号转导激活因子(FGFsignaltransductionactivator)、和(ii)ROCK抑制剂的培养基培养的工序；[2]根据上述[1]所述的增殖方法，其中，培养基进一步含有(iii)Wnt信号抑制剂；[3]根据上述[1]或[2]所述的增殖方法，其中，所述胰腺祖细胞为通过将PDX1阳性细胞用含有(a)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(b)Wnt信号抑制剂的培养基培养而诱导的胰腺祖细胞；[4]胰腺祖细胞的增殖用试剂，其含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂；[5]胰腺祖细胞的增殖用试剂盒，其含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂；[6](i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的用途，其用于增殖胰腺祖细胞；[7]胰腺祖细胞的制备方法，其包括将胰腺祖细胞用含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的培养基培养并进行增殖的工序，和从培养物中提取胰腺祖细胞的工序；[8]根据上述[7]记载的制备方法,其包括将PDX1阳性细胞用含有(a)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(b)Wnt信号抑制剂的培养基培养，并诱导分化成胰腺祖细胞的工序。需要说明的是，在上述[1]～[8]中，所述胰腺祖细胞及PDX1阳性细胞优选为人胰腺祖细胞及人PDX1阳性细胞。专利技术的效果根据本专利技术，可以高效率且高纯度的制备难以在活体外增殖的胰腺祖细胞。本专利技术的方法除了源自活体的胰腺祖细胞以外，也可以适用于由ES细胞及iPS细胞等多功能性干细胞而诱导分化的胰腺祖细胞。得到的胰腺祖细胞可以直接或者诱导分化成胰腺β细胞等而利用于糖尿病的治疗、糖尿病治疗药的试验方法等。附图说明[图1]实施例1中诱导的胰腺祖细胞的染色图像。(i)对照、(ii)XAV939、(iii)添加bFGF、(iv)XAV939+bFGF。NKX6.1阳性细胞由于Alexa568而呈现红色，PDX1阳性细胞由于Alexa488而呈现绿色，细胞的核由于Hoechst33342而呈现蓝色。在组合添加XAV939和bFGF的情况下，PDX1阳性且NKX6.1阳性细胞的比例最高。[图2]实施例2中诱导的胰腺祖细胞的染色图像。(i)XAV939、(ii)XAV939+EGF、(iii)XAV939+Betacellulin、(iv)XAV939+bFGF。NKX6.1阳性细胞由于Alexa568而呈现红色，PDX1阳性细胞由于Alexa488而呈现绿色，细胞的核由于本文档来自技高网...

【技术保护点】
胰腺祖细胞的增殖方法，其中，对胰腺祖细胞进行以下工序(1)：(1)用含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的培养基培养的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.04 JP 2014-1584701.胰腺祖细胞的增殖方法，其中，对胰腺祖细胞进行以下工序(1)：(1)用含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(ii)ROCK抑制剂的培养基培养的工序。2.根据权利要求1所述的增殖方法，其中，培养基进一步含有(iii)Wnt信号抑制剂。3.根据权利要求1所述的增殖方法，其中，胰腺祖细胞为通过将PDX1阳性细胞用含有(a)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因子、和(b)Wnt信号抑制剂的培养基培养而诱导的胰腺祖细胞。4.胰腺祖细胞的增殖用试剂，其含有(i)EGF信号转导激活因子和/或FGF信号转导激活因...

【专利技术属性】
技术研发人员：国贞祐哉，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP