一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法技术

本发明专利技术公开了免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法。该方法包括：利用CD16抗体包被培养容器，得到包被后的培养容器；利用免疫细胞激活培养基将单个核细胞置于包被后的培养容器中进行第一诱导扩增培养，得到初步诱导扩增的免疫细胞；利用免疫细胞扩增培养基将初步诱导扩增的免疫细胞进行第二诱导扩增培养，得到分化的免疫细胞；利用免疫细胞规模化扩增培养基将分化的免疫细胞进行第三诱导扩增培养，获得大规模的功能激活的免疫细胞；利用免疫细胞冻存液冻存免疫细胞，得到冻存的免疫细胞；将冻存的免疫细胞水浴融化，并与免疫细胞的冷冻复苏液混合，得到复苏细胞混合液；将复苏细胞混合液进行离心处理，得到复苏的免疫细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法。
技术介绍
近年来，生物治疗己经成为继手术、放化疗及内分泌治疗之后的第五大治疗模式，并逐渐受到重视。过继性细胞免疫治疗法(ACI)是细胞生物治疗方法之一，它是指向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤细胞或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。目前在临床上应用过继性免疫细胞包括DC-CIK细胞、TIL细胞、LAK细胞及NK细胞，其中，CIK细胞、LAK细胞和A-NK细胞都是以自然杀伤细胞为主体的抗癌体系。自然杀伤细胞(naturalkillercells)也叫做NK细胞，主要来源于骨髓CD34+的淋巴细胞，分布在骨髓、外周血和脾脏，占外周血淋巴细胞的10％-20％。NK细胞在肿瘤免疫、清除非己细胞等方面发挥重要作用：它是天然免疫防御的主要组成，位于机体防御体系的第一道防线，NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，可无需抗原预先致敏即可识别并杀死肿瘤及病毒感染的细胞，通过穿孔素-颗粒酶途径和Fas-FasL通路直接对肿瘤细胞发挥细胞毒作用杀伤肿瘤细胞；同时它又能在发病早期分泌多种细胞因子和趋化因子如TNF-α、IFN-γ和IL-1等，这些细胞因子参与抗癌和调节获得性免疫应答，故NK细胞也是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁。虽然NK细胞的抗癌效果的安全性和疗效得到肯定，但由于它仅占外周血淋巴细胞的10％-20％，因而如何获得高纯度、高质量地NK细胞产品是NK治疗的关键。近几年发现通过体外的刺激培养可进行相对大规模的NK细胞制备，己知IL-2、IL-15、IL-18和IL-7等细胞因子在对NK细胞的体外扩增上发挥重要作用，它们体外扩增NK细胞的倍数在几倍至数十倍不等。IL-2是重要的诱导NK细胞增殖的细胞因子，它可以激活NK细胞、促进NK细胞增殖和细胞因子的产生。IL-15和IL-7的作用与IL-2相似，同时它们还可通过与NK细胞表面表达的复合受体γ链结合，促进造血干细胞定向分化为NK细胞，且对NK细胞的发育、分化和维持长期体外存活等方面发挥重要作用。IL-15与IL-2的协同作用也使两者联合作用于NK细胞的体外扩增，是目前NK细胞体外扩增最传统的细胞因子组合。据报道IL-18不但能诱导活化的THi细胞分泌产生大量的IFN-γ，更能通过促进Fas-FasL通路的开放，增强NK细胞的细胞毒性，且呈剂量依赖性。但目前市场上已有NK细胞治疗产品存在，但冻存后复苏效果差、使用的培养体系繁杂、扩增倍数及杀瘤效果不佳，部分培养体系存在安全风险等问题。由此，自然杀伤细胞的培养、冻存和复苏方法有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，该方法诱导扩增免疫细胞，诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低，并且诱导扩增获得的大规模的功能激活的免疫细胞长期保存后复苏依然保持良好的细胞特性。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：利用CD16抗体包被培养容器，以便得到包被后的培养容器；利用免疫细胞激活培养基将单个核细胞置于所述包被后的培养容器中进行第一诱导扩增培养，以便得到初步诱导扩增的免疫细胞；利用免疫细胞扩增培养基将所述初步诱导扩增的免疫细胞进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的免疫细胞；利用免疫细胞规模化扩增培养基将所述分化的免疫细胞进行第三诱导扩增培养，以便获得大规模的功能激活的免疫细胞；利用免疫细胞冻存液冻存所述大规模的功能激活的免疫细胞，以便得到冻存的免疫细胞；将所述冻存的免疫细胞置于37-42℃水浴中融化，并与免疫细胞的冷冻复苏液混合，以便得到复苏细胞混合液；以及将所述复苏细胞混合液进行离心处理，以便得到复苏的免疫细胞，其中，所述免疫细胞激活培养基为添加了第一血浆、白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；所述免疫细胞扩增培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；所述免疫细胞规模化扩增培养基为添加了白介素-2的无血清淋巴细胞培养基；所述免疫细胞冻存液包含2-10体积％的DMSO、2-15体积％的HSA、20-88体积％的第二血浆和余量冻存培养基；白酒草系菊科白酒草属植物Conyzajaponica(Thunb.)Less的全草，颜世伦等曾经报道从白酒草中分离得到化合物白酒草皂苷R，结构鉴定为3-O-β-D-glucopyranosylmedicagenicacid28-O-β-D-apiofuranosyl-(1→3)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[β-D-apiofuranosyl-(1→3)]-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosylester，其结构式为：本专利技术人还惊讶地发现，微量白酒草皂苷R，血浆和HSA(人血清白蛋白，HumanSerumAlbumin)与DMSO结合制备免疫细胞的冻存液，可以降低DMSO的使用量，这种冻存液对冻存细胞有较好的保护作用，冻存细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种免疫细胞冻存液，其包含0.2-0.8体积％的DMSO；2-15体积％的HSA；0.001g/ml的白酒草皂苷R，20-88体积％的血浆；以及余量培养基。专利技术人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于冻存免疫细胞，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，并且细胞回收率高。所述冷冻复苏液包含白蛋白和右旋糖酐。专利技术人惊奇地发现，利用该方法对单个核细胞进行诱导扩增培养得到大规模的免疫细胞，具有诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低等优点。并且，该方法冻存的大规模的免疫细胞，有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高，从而满足临床治疗大量免疫细胞的需要。另外，根据本专利技术上述实施例的免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法还可以具有如下附加的技术特征：根据本专利技术的实施例，所述免疫细胞激活培养基和所述免疫细胞扩增培养基中，所述沙培林的浓度均为0.007-0.013KE/ml，优选地，为0.01KE/ml。根据本专利技术的实施例，所述免疫细胞激活培养基、所述免疫细胞扩增培养基和所述免疫细胞规模化扩增培养基中，所述白介素-2的浓度均为700-1300IU/ml，优选地，为1000IU/ml。根据本专利技术的实施例，所述免疫细胞激活培养基、所述免疫细胞扩增培养基和所述免疫细胞规模化扩增培养基中，所述无血清淋巴细胞培养基均为OpTmizerTMCTSTM无血清培养基或SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基。根据本专利技术的实施例，所述免疫细胞激活培养基中，所述第一血浆的浓度为7-13体积％，优选地，为10体积％。根据本专利技术的实施例，所述第一血浆和所述第二血浆均为自体血浆。根据本专利技术的实施例，所述免疫细胞冻存液中，所述DMSO的浓度为10体积％；所述HSA的浓度为5体积％；所述第二血浆的浓度为40体积％；所述冻存培养基为1640培养基或Stemspan培养基。根据本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，其特征在于，包括：利用CD16抗体包被培养容器，以便得到包被后的培养容器；利用免疫细胞激活培养基将单个核细胞置于所述包被后的培养容器中进行第一诱导扩增培养，以便得到初步诱导扩增的免疫细胞；利用免疫细胞扩增培养基将所述初步诱导扩增的免疫细胞进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的免疫细胞；利用免疫细胞规模化扩增培养基将所述分化的免疫细胞进行第三诱导扩增培养，以便获得大规模的功能激活的免疫细胞；利用免疫细胞冻存液冻存所述大规模的功能激活的免疫细胞，以便得到冻存的免疫细胞；将所述冻存的免疫细胞置于37‑42℃水浴中融化，并与免疫细胞的冷冻复苏液混合，以便得到复苏细胞混合液；以及将所述复苏细胞混合液进行离心处理，以便得到复苏的免疫细胞，其中，所述免疫细胞激活培养基为添加了第一血浆、白介素‑2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；所述免疫细胞扩增培养基为添加了白介素‑2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；所述免疫细胞规模化扩增培养基为添加了白介素‑2的无血清淋巴细胞培养基；所述免疫细胞冻存液包含2‑10体积％的DMSO、2‑15体积％的HSA、20‑88体积％的第二血浆和余量冻存培养基；所述冷冻复苏液包含白蛋白和右旋糖酐。...

【技术特征摘要】
1.一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，其特征在于，包括：利用CD16抗体包被培养容器，以便得到包被后的培养容器；利用免疫细胞激活培养基将单个核细胞置于所述包被后的培养容器中进行第一诱导扩增培养，以便得到初步诱导扩增的免疫细胞；利用免疫细胞扩增培养基将所述初步诱导扩增的免疫细胞进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的免疫细胞；利用免疫细胞规模化扩增培养基将所述分化的免疫细胞进行第三诱导扩增培养，以便获得大规模的功能激活的免疫细胞；利用免疫细胞冻存液冻存所述大规模的功能激活的免疫细胞，以便得到冻存的免疫细胞；将所述冻存的免疫细胞置于37-42℃水浴中融化，并与免疫细胞的冷冻复苏液混合，以便得到复苏细胞混合液；以及将所述复苏细胞混合液进行离心处理，以便得到复苏的免疫细胞，其中，所述免疫细胞激活培养基为添加了第一血浆、白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；所述免疫细胞扩增培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；所述免疫细胞规模化扩增培养基为添加了白介素-2的无血清淋巴细胞培养基；所述免疫细胞冻存液包含2-10体积％的DMSO、2-15体积％的HSA、20-88体积％的第二血浆和余量冻存培养基；所述冷冻复苏液包含白蛋白和右旋糖酐。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞激活培养基和所述免疫细胞扩增培养基中，所述沙培林的浓度均为0.007-0.013KE/ml，优选地，为0.01KE/ml，任选地，所述免疫细胞激活培养基、所述免疫细胞扩增培养基和所述免疫细胞规模化扩增培养基中，所述白介素-2的浓度均为700-1300IU/ml，优选地，为1000IU/ml，任选地，所述免疫细胞激活培养基、所述免疫细胞扩增培养基和所述免疫细胞规模化扩增培养基中，所述无血清淋巴细胞培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐智峰，张新，
申请(专利权)人：广州沙艾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44