一种重组蛋白的提取纯化方法技术

重组蛋白的提取纯化方法，其特征在于按照下述步骤进行：（1）安装逆流超声设备，超声波控制器控制聚能式超声波探头发出超声作用于杯型超声腔缓冲液A中，超声腔进出口带有阀门A和阀门B，蠕动泵通过两条管道与烧杯中缓冲液B连接，烧杯中缓冲液B在搅拌器的搅拌已保证充分反应，烧杯置于装有冰水混合物的容器中，液体的定向循环流动由安装在进口管道上的蠕动泵完成；（2）取重组大肠杆菌单克隆接种至含50?μg/ml卡那霉素LB液体培养基恒温摇床培养过夜，将过夜菌接种于同样培养基中，其中接种量为1%，恒温摇床培养至OD600为0.8时，添加异丙基?β?D?硫代半乳糖苷至终浓度?1?mM，28℃?37℃诱导培养6?h?12h，离心收集湿菌体，进行反复冻融法处理（?20°C/37°C）5次；（3）关上逆流超声设备的阀门，超声腔中加入工程菌湿菌体和缓冲溶液A，其中工程菌和缓冲溶液A的质量与体积比为1：30（g/ml），利用功率为400?600W超声进行细胞破碎处理，至液体变稀；（4）在冰浴的烧杯中加入缓冲溶液B，打开逆流超声设备的阀门，打开蠕动泵，打开搅拌器，使液体在超声腔和烧杯内循环，超声工作15?min?20?min（400?600?W）；其中缓冲溶液A和缓冲溶液B的体积比为1：3；（5）将混合液于4℃下8000?rpm离心20?min，收集沉淀，溶于6?8?M尿素，4℃下10000?rpm离心20?min取上清，上清液经脱盐柱脱盐得纯化重组蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术，属生物工程领域。此方法特别适合一类以包涵体形式表达的重组蛋白，这类重组蛋白在低浓度变性剂环境中对超声促溶作用不敏感。本工艺的特征在于利用逆流超声设备依次进行工程菌破碎和去除包涵体中杂蛋白，从而实现重组蛋白的纯化。本专利技术与已有的技术相比，工艺简单和成本低，在保证产品纯度前提下，回收率相应提高，适用于重组蛋白大批量纯化。【专利说明】
本专利技术涉及生物工程领域，特别是指一种基因工程菌表达的重组蛋白提取纯化方法。
技术介绍
通常外源基因的表达，特别是来自真核生物的基因在原核生物(如大肠杆菌)中的表达，由于宿主菌缺乏此种基因相应的表达调控机制，以及细胞内的化学环境与其天然环境差异(如氧化还原环境、胞内pH、自由水的浓度等)，这些使得宿主的细胞在非正常状态下生长，导致所表达的蛋白质多数以无活性的包涵体的形式存在。包涵体是微生物细胞中密度最大的结构，密度在1.1-1.3之间，对机械搅拌和超声破碎作用不敏感。以包涵体形式表达的蛋白质在下游生产过程中具有一些优越性。表现在: (1)异源表达的蛋白质很容易被宿主细胞内的蛋白质酶降解，而以包涵体形式表达重组蛋白质，由于包埋了蛋白酶水解的作用位点，可以最大限度地降低细胞内降解； (2)包涵体蛋白没有活性，细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质高级结构变化引起的失活问题； (3)与可溶性形式表达的重组蛋白相比，包涵体形式表达的蛋白与宿主细胞其他蛋白的分离更加简便和低成本，使用简单的离心或者过滤方法就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白成分进行有效的分离； (4)有些表达的外源蛋白对细胞有毒性或致死效应，大量表达时会导致细胞的生长缓慢或死亡，最终的细胞数量和产物相当低，而以包涵体形式表达的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达和积累。以包涵体表达的重组蛋白提取纯化方法通常为:工程发酵和诱导表达，离心收集细胞，细胞破碎，离心收集沉淀，包涵体洗涤，离心收集沉淀(重复洗涤离心若干次)，包涵体变性溶解，离心收集上清，纯化(亲和纯化和稀释沉淀法等)。此类方法有如下缺点: (I)操作繁琐，需要多次离心操作，成本高，不适合放大连续操作。(2)所用溶剂种类多，细胞破碎，包涵体清洗，包涵体溶解纯化都需要多种特定的缓冲液，成本高，不利于大规模生产。
技术实现思路
为克服已有技术存在的问题，本专利技术的目的提供一种工艺简单，所需要的溶剂少，成本低，产品的纯度和回收均高，适合大批量生产重组蛋白的纯化方法。本专利技术提供的重组蛋白的提取纯化方法，按照下述步骤进行: (I)安装逆流超声设备，超声波控制器控制聚能式超声波探头发出超声作用于杯型超声腔缓冲液A中，超声腔进出口带有阀门A和阀门B，蠕动泵通过两条管道与烧杯中缓冲液B连接，烧杯中缓冲液B在搅拌器的搅拌已保证充分反应，烧杯置于装有冰水混合物的容器中，液体的定向循环流动由安装在进口管道上的蠕动泵完成。(2)取重组大肠杆菌单克隆接种至含卡那霉素(50 μ g/ml) LB液体培养基(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L, pH 7.0)恒温摇床培养过夜，将过夜菌接种于同样培养基中，其中接种量为1%，恒温摇床培养至0D_为0.8时，添加异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度I mM，28°C-37°C诱导培养6 h_12h，离心收集湿菌体，进行反复冻融法处理(-20° C/37° C)5次。(3)关上逆流超声设备的阀门，超声腔中加入工程菌湿菌体和缓冲溶液A (50 mMTris,10 mM EDTA，100 mM NaCl, pH 7.5)，其中工程菌和缓冲溶液A的质量与体积比为1:30 (g/ml)。利用超声(400-600W)进行细胞破碎处理，至液体变稀，镜检细菌破碎率为98%。(4)在冰浴的烧杯中加入缓冲溶液B(50 mM Tris, 10 mM EDTA，100 mM NaCl, 1.5-2M urea, pH 7.5)，打开逆流超声设备的阀门，打开蠕动泵，打开搅拌器，使液体在超声腔和烧杯内循环，超声工作15 min-20 min (400-600 W);其中缓冲溶液A和缓冲溶液B的体积比为1:3。(5)将混合液于4°C下8000 rpm离心20 min，收集沉淀，溶于6-8 M尿素，4°C下10000 rpm离心20 min取上清，上清液经脱盐柱脱盐得纯化重组蛋白。本专利技术的优点: 本专利技术中细胞破碎和包涵体纯化均在逆流超声设备中完成，同常规离心方法(如利用超声细胞破碎 仪破碎细胞，离心去沉淀，用缓冲液对沉淀包涵体进行悬浮清洗离心操作若干次)相比简少了操作量，减少了试剂使用量，同亲和色谱方法相比，由于没有使用相对昂贵的亲和色谱填料，成本低且适合大量制备重组蛋白。在逆流超声设备的包涵体纯化操作中，在超声波作用下，沉淀中颗粒变的更小且分散均匀，相比对超声促溶作用不敏感的重组蛋白包涵体，颗粒中细胞组成性蛋白和核酸等物质更加容易溶解在含有低浓度变性剂(尿素)缓冲液中，然后通过一次离心使得重组蛋白得到纯化。相比传统的包涵体纯化方法，此方法操作简便，成本低。下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。【专利附图】【附图说明】图1为逆流超声设备结构示意图，其中I为超声波控制器，2为聚能式超声波探头，3为缓冲液A，4为阀门A，5为阀门B，6为蠕动泵，7为缓冲液B，8为冰水混合物，9为搅拌器。图2为逆流超声设备的细胞破碎工作状态示意图(局部)。图3为逆流超声设备的包涵体纯化工作状态示意图(局部)。【具体实施方式】在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。实施例中所用方法对照的方法具体如下实施: 逆流超声设备如附图1所示，超声波控制器I控制聚能式超声波探头2发出超声作用于杯型超声腔缓冲液A (图1中的3)中，超声腔进出口带有阀门A和阀门B (图1中4和5)，蠕动泵6通过两条管道与烧杯中缓冲液B (图1中的7)连接，烧杯中缓冲液B在搅拌器9的搅拌已保证充分反应，烧杯置于装有冰水混合物8的容器中，液体的定向循环流动由安装在进口管道上的蠕动泵6完成。实施例所用的重组菌种为大肠杆菌BL21-MF3A3 (已申请专利，专利申请号为:CN201010546991)和大肠杆菌BL21-M32PD，(已申请专利，专利申请号为CN201010547009)。对比方法(镍柱亲和纯化): 1、工程菌的发酵和诱导表达 取重组大肠杆菌(BL21-MF3A3或BL21-M32H))单克隆接种至5 ml卡那霉素(50 μ g/ml)LB液体培养基(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L, pH7.0) 37°C, 180 rpm培养过夜，按1%接种量将过夜菌接种于50 ml同样的新鲜LB培养基中，37°本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组蛋白的提取纯化方法，其特征在于按照下述步骤进行：（1）安装逆流超声设备，超声波控制器控制聚能式超声波探头发出超声作用于杯型超声腔缓冲液A中，超声腔进出口带有阀门A和阀门B，蠕动泵通过两条管道与烧杯中缓冲液B连接，烧杯中缓冲液B在搅拌器的搅拌已保证充分反应，烧杯置于装有冰水混合物的容器中，液体的定向循环流动由安装在进口管道上的蠕动泵完成；（2）取重组大肠杆菌单克隆接种至含50?μg/ml卡那霉素LB液体培养基恒温摇床培养过夜，将过夜菌接种于同样培养基中，其中接种量为1%，恒温摇床培养至OD600为0.8时，添加异丙基?β?D?硫代半乳糖苷至终浓度?1?mM，28℃?37℃诱导培养6?h?12h，离心收集湿菌体，进行反复冻融法处理（?20°C/37°C）5次；（3）关上逆流超声设备的阀门，超声腔中加入工程菌湿菌体和缓冲溶液A，其中工程菌和缓冲溶液A的质量与体积比为1：30（g/ml），利用功率为400?600W超声进行细胞破碎处理，至液体变稀；（4）在冰浴的烧杯中加入缓冲溶液B，打开逆流超声设备的阀门，打开蠕动泵，打开搅拌器，使液体在超声腔和烧杯内循环，超声工作15?min?20?min（400?600?W）；其中缓冲溶液A和缓冲溶液B的体积比为1：3；（5）将混合液于4℃下8000?rpm离心20?min，收集沉淀，溶于6?8?M尿素，4℃下10000?rpm离心20?min取上清，上清液经脱盐柱脱盐得纯化重组蛋白。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马海乐，李云亮，张赫男，张艳艳，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：