核酸分析法制造技术

实施方式涉及对于样本的核酸分析法。核酸分析法包括：将样本用第1引物和第2引物进行扩增反应，使扩增反应产物与核酸探针反应，测定杂交的有无和/或量，确定样本中的目标核酸的有无和/或存在量。由第1引物和/或第2引物产生的扩增产物形成茎环结构体。通过检出与环结构的序列互补的核酸探针和扩增产物的杂交的有无和/或存在量，来对于样本进行核酸分析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】实施方式涉及对于样本的。包括：将样本用第1引物和第2引物进行扩增反应，使扩增反应产物与核酸探针反应，测定杂交的有无和/或量，确定样本中的目标核酸的有无和/或存在量。由第1引物和/或第2引物产生的扩增产物形成茎环结构体。通过检出与环结构的序列互补的核酸探针和扩增产物的杂交的有无和/或存在量，来对于样本进行核酸分析。【专利说明】
本专利技术的实施方式涉及。
技术介绍
在基因分析中，作为检出或定量具有特定序列的核酸的一般手法之一，有使用PCR扩增法的方法。在该方法中，将样本进行PCR扩增之后，对于扩增产物检出特定序列的有无或定量其存在量。在PCR扩增法中，使用用于扩增要检出或定量的目的序列的引物组，以样本所含的核酸作为模板核酸进行扩增。所得的扩增产物通过热处理等分解或分离成单链之后，例如，与用于检出目的序列的核酸探针反应。以由此生成的杂交的有无或量作为指标而最终实现目的序列的检出和/或定量。来自扩增产物的单链具有通过其序列而形成二级结构的倾向。另外，通过PCR扩增法获得的扩增产物包含彼此互补的双链。因此，为了供于检出和/或定量而被单链化，但单链化后的样品中存在包含彼此互补的序列的二种单链。因此，检出和/或定量中或检出和/或定量以前，有在样品中相遇的互补链彼此之间自发地形成双链的倾向。关于单链的这些倾向，可能在进行检出和/或定量上形成障碍。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术所要解决的课题是提供能够正确、简便且短时间地进行的。用于解决课题的方法实施方式涉及对于样本的。包括:将样本用第I引物和第2引物进行扩增反应，使扩增反应产物与核酸探针反应，测定杂交的有无和/或量，确定样本中的目标核酸的有无和/或存在量。由第I引物和/或第2引物产生的扩增产物形成茎环结构体。通过检出与环结构的序列互补的核酸探针和扩增产物的杂交的有无和/或存在量，来对于样本进行核酸分析。【专利附图】【附图说明】图1是显示实施方式中的扩增工序的I例的模式图。图2是显示实施方式中的扩增工序的I例的模式图。图3是显示实施方式中的扩增工序的I例的模式图。图4是显示实施方式中的扩增工序的I例的模式图。图5是显示实施方式中的扩增工序的I例的模式图。图6是显示实施方式中的扩增工序的I例的模式图。图7是显示实施例1的引物和探针的设计位置的图。图8是显示实施例1的电泳结果的图。图9是显示实施例1的检出结果的图。图10是显示实施例2的检出结果的图。图11是显示实施例2的检出结果的图。图12是显示实施例3的检出结果的图。图13是显示实施方式中的DNA芯片的I例的图。图14是显示实施方式中的DNA芯片的I例的图。【具体实施方式】以下，对于本专利技术的实施方式进行详细说明。“扩增”或“扩增反应”是指使用引物组反复复制模板核酸，包含延伸工序和扩增工序等工序。扩增基本上可以是能够使用包含2种引物、例如正向引物和反向引物的引物组复制模板核酸的、其本身公知的任何方法。例如，优选PCR扩增方法、LCR扩增方法、RCA扩增方法、TMA扩增方法、NASBA扩增方法、SDA扩增方法和ICAN扩增方法。另外，根据需要，可以与该扩增反应同时组合进行使用逆转录酶的逆转录反应。同时进行扩增反应和逆转录反应的技术可以利用 其本身公知的任何技术。“核酸”是概括地表示DNA、RNA、PNA、LNA、S-寡核苷酸、膦酸甲酯寡核苷酸等可以将其一部分结构用碱基序列表示的物质的术语。例如，核酸可以是来源于天然的DNA和RNA等、一部分或完全人工合成和/或设计的人工核酸等、以及它们的混合物等。“样本”是指应按照本实施方式进行分析方法的对象，只要是可能包含核酸的样品就可以。样本优选是不妨碍扩增反应和/或杂交反应的状态。例如，为了将从生物体等获得的材料作为按照本实施方式的样本使用，可以通过其本身公知的任何手段进行前处理。例如,样本可以是液体。将样本所含的核酸称为“受检核酸”。将样本核酸中包含要与引物退火而进行复制的多核苷酸的核酸称为“模板”。将模板中由引物组所含的2种引物所规定的部分称为“模板核酸”。进而对于“模板核酸”，将除了引物的结合区域(也称为“退火区域”)以外的区域在这里称为“模板序列”。“目标序列”是要使用核酸探针进行检出或定量的序列。“目标核酸”是包含目标序列的核酸，且是指在由引物从模板核酸复制出的核酸中的包含目标序列的核酸。在利用引物的复制是延伸的情况下，是包含目标序列的延伸产物，在利用引物的复制是扩增的情况下，是指包含目标序列的“扩增产物”。另外，也将“延伸产物”和“扩增产物”称为“复制链”。“核酸探针”是包含相对于目标序列为互补的序列的核酸。核酸探针可以以游离的状态使用，也可以固定化于其本身公知的固相。优选的核酸探针被固定化于基体表面而使用。包含这样的基体、和被固定化于基体的核酸探针的装置一般可以通过DNA芯片来进行。“DNA芯片”是利用具有与要检出的核酸互补的序列的核酸探针、和检出对象核酸之间的杂交反应，来分析核酸的装置。DNA芯片的术语与一般使用的“核酸芯片”、“微阵列”和“DNA阵列”等用语同义，可以互换地使用。“来源于模板序列的序列”(或“来源于模板序列的互补序列的序列”)，是指反映了关于在引物组分别与模板核酸(或其互补序列)退火之后、由这些引物所规定的模板序列(或其互补序列)所含的区域的序列的序列信息，即，关于碱基序列和/或其序列的方向等信息的序列。“互补”和“互补链”可以在2个单链核酸彼此具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%或100%的互补性的情况下使用。“同源”和“同源链”可以在2个单链核酸彼此具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的同源性的情况下使用。(I)模板核酸首先，在进行实施方式的核酸分析方法之前调制样本。样本只要是可能包含核酸、希望对于其中所含的核酸进行分析的对象即可。样本需要在其中适当地进行扩增反应，因而根据需要可以对于从要分析的对象得到的粗样本进行前处理而作为样本，另外，在适合扩增反应的情况下，也可以不进行前处理而将粗样本直接作为样本使用。在样本中存在具有要分析的序列的核酸的情况下，它们被作为最初的模板核酸使用。被作为模板核酸使用的受检核酸可以是单链也可以是双链。即使在假设对于单链的受检核酸开始扩增的情况下，扩增过程中其互补链也被复制。因此，当初存在的模板核酸作为第I模板核酸发挥功能，被复制，在扩增过程中形成的该模板核酸的互补链作为第2模板核酸发挥功能。(2)茎环结构体莖环结构体具有 例如在图1中用符号110表不的分子内结构,具有单链环部分和包含茎部分的双链部分。在本实施方式中，形成2种茎环结构体。I种是前述的符号110所示的、具有存在于5’末端侧的茎部分、与该茎部分的3’侧邻接的环部分、以及包含与该茎部分互补的序列的存在于3’末端侧的双链部分、和直链的单链部分的茎环结构体(图1)。另一种是符号115所示的茎环结构体。该茎环结构体含有:包含环部分的单链区域、和包含茎部分的双链区域。这2种茎环结构体可以通过使用包含针对I种模板核酸的正向引物和反向引物的I组引物组进行扩增反应来获得。(3)对于作为实施方式的I例的进行说明。成为分析的对象的样本首先被正向引物和反向引物扩增。接着，使由此得到的扩增产物与包本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸分析法，是对于样本的核酸分析法，应被扩增的核酸包含第1模板核酸和第2模板核酸，所述第1模板核酸包含位于3’端的第1序列、与该第1序列的5’侧邻接的第1模板序列、和与该第1模板序列的5’侧邻接且位于5’端的第2序列，以及所述第2模板核酸是所述第1模板核酸的互补链，包含位于其3’端的第3序列、与该第3序列的5’侧邻接的第2模板序列、和与该第2模板序列的5’侧邻接且位于5’端的第4序列，该核酸分析法具备以下(a‑1)、(a‑2)、(b)、(c)、(d)和(e)的工序：(a‑1)准备用于扩增所述第1模板核酸和所述第2模板核酸的第1引物和第2引物，这里，所述第1引物包含作为所述第1序列的互补序列的S1序列、和与所述S1序列的5’端侧连接的S2序列，所述S2序列是作为所述第1模板序列的至少一部分的与所述第1序列的5’侧邻接或位于所述第1序列的5’侧的附近的序列，以及所述第2引物包含作为所述第3序列的互补序列的S3序列，并且与所述第1引物的延伸链对应的第1复制链，在其同一链上形成第1茎环结构体，该第1茎环结构体含有：包含第1茎部分的第1双链区域、和构成第1环部分的第1单链区域，所述第1双链区域包含来源于所述S2序列的第1茎部分和与该第1茎部分互补的来源于所述第1模板序列的互补序列的序列，所述构成第1环部分的第1单链区域包含所述S1序列，以及与所述第2引物的延伸链对应的第2复制链，在其同一链上形成第2茎环结构体，该第2茎环结构体含有：包含第2茎部分的第2双链区域、 和构成第2环部分的第2单链区域，所述第2双链区域包含来源于所述S2序列的互补序列的第2茎部分和与该第2茎部分互补的来源于所述第2模板序列的互补序列的序列，所述构成第2环部分的第2单链区域包含所述S1序列的互补序列，(a‑2)准备用于检出所述第1复制链和/或所述第2复制链的第1核酸探针和/或第2核酸探针，这里，所述第1核酸探针是所述第1复制链的所述构成第1环部分的第1单链区域的至少一部分的序列，所述第2核酸探针是所述第2复制链的所述构成第2环部分的第2单链区域的至少一部分的序列，(b)使用所述第1引物和第2引物来扩增所述样本，(c)使所述(b)中获得的扩增产物与所述第1核酸探针和/或第2核酸探针反应，(d)检出所述第1核酸探针和/或第2核酸探针与所述扩增产物的杂交的有无，和/或测定杂交量，(e)基于所述(d)的结果，确定所述样本中的所述目标核酸的有无，和/或确定存在量。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：中村奈绪子，桥本幸二，桥本美智惠，源间信弘，二阶堂胜，
申请(专利权)人：株式会社东芝，
类型：发明
国别省市：日本;JP