一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，该试剂盒由试剂A、试剂B、试剂C、试剂D、试剂E、产品说明书和试验结果记录卡组成；使用本试剂盒，按本发明专利技术所提供的方法，可不通过纯培养直接检测出罗非鱼血液中是否携带无乳链球菌，并能对血液中无乳链球菌的数量进行半定量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒
本专利技术涉及一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒。
技术介绍
罗非鱼是全球主要经济鱼类之一，具有生长快、抗病力与抗逆性强、肉质好、繁殖力强、适应性广以及群体产量高等一系列优点，现已成为南方各省出口型养殖规模最大的鱼类，产量占全世界的50％，罗非鱼产业对于增加就业机会、提高农民收入都有十分重要的意义。然而近年来，由于高密度饲养，种群退化，加上养殖水质、环境及气候恶化，各类病害时常大面积爆发，严重影响到罗非鱼产业的健康发展。2009~2013年，国内主要的罗非鱼养殖区爆发了非常严重的罗非鱼流行病，患病罗非鱼在水面离群独游，游姿失衡，眼球突出，被养殖户形象的称为“突眼病”。该病发病率一般达20％～30％，死亡率在95％以上。病原分析表明引起罗非鱼“突眼病”的病原为链球菌，主要为海豚链球菌(Streptococcusiniae)和无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)。据统计，近几年因链球菌病导致罗非鱼产业的损失达20亿元，如何防治罗非鱼链球菌病已成为农业和渔业管理部门最为关注的问题。无乳链球菌是罗非鱼链球菌病最主要的病原菌，在养殖过程中定期检测罗非鱼是否受到无乳链球菌的感染，是预防链球菌病的一种有效措施。目前已公开的专利和论文中，有使用分子诊断方法检测无乳链球菌的报道，这些方法虽然能够特异性的检测无乳链球菌，但有明显的缺点：(1)检出灵敏度低，多数情况只适用于纯培养后菌体的检测，无法做到免培养检测；(2)部分灵敏度高的检测方法，如LAMP法，只能定性判断出罗非鱼是否感染无乳链球菌，而对于感染程度，即罗非鱼体内无乳链球菌的含量无法进行检测。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高，解决了上述现有技术的不足之处。解决上述技术问题的技术方案是：一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，该试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和试剂E；所述的试剂A的组成成分为：引物P1s0.4μM；引物P1a0.4μM；DNA聚合酶0.1U/μl；dATP、dCTP、dTTP和dGTP各500μM；MgCl23mM；KCl100mM，pH值为8.3的Tris-HCl20mM；吐温200.005%；甘油0.5%；所述的试剂B的组成成分为：引物P2s0.4μM；引物P2a0.4μM；DNA聚合酶0.1U/μl；dATP、dCTP、dTTP和dGTP各500μM；MgCl23mM；KCl100mM，pH值为8.3的Tris-HCl20mM；吐温200.005%；甘油0.5%；所述的试剂C为溶质是柠檬酸钠、枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种的溶液，试剂C的浓度0.1%-0.5%；所述的试剂D为去离子水；所述的试剂E为无乳链球菌cfb基因或含cfb基因的质粒，该试剂E中cfb基因的拷贝数为1×108拷贝/ml；所述的试剂A中引物P1s的序列为：5’-TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3’，引物P1a的序列为5’-CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3’；所述的试剂B中引物P2s的序列为：5’-ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG-3’，引物P2a的序列为5’-CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC-3’。由于采用上述技术方案，本专利技术之一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，具有以下有益效果：针对上述现有技术的情况，本专利技术公开了一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量的检测试剂盒。该试剂盒利用巢式PCR的方法对无乳链球菌特异基因cfb基因进行检测，大大提高了检测灵敏度。配合试剂盒中的血液抗凝剂，可不通过纯培养，以罗非鱼的血液为模板直接对无乳链球菌进行检测。对照标准反应结果，即可判断罗非鱼血液内无乳链球菌的含量。该方法可不通过纯培养而特异、快速检测罗非鱼血液是否携带无乳链球菌，并且可实现半定量检测，从而判断罗非鱼感染无乳链球菌的程度，为罗非鱼链球菌病的预防提供新的技术手段。具体实施方式一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，该试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D、试剂E、产品说明书和试验结果记录卡；所述的试剂A含有0.4μM引物P1s、0.4μM引物P1a、0.1U/μlDNA聚合酶、500μMdATP、500μMdCTP、500μMdTTP、500μMdGTP、3mMMgCl2、100mMKCl、20mMpH值为8.3的Tris-HCl、0.005%吐温20和0.5%甘油；所述的试剂B含有0.4μM引物P2s、0.4μM引物P2a、0.1U/μlDNA聚合酶、500μMdATP、500μMdCTP、500μMdTTP、500μMdGTP、3mMMgCl2、100mMKCl、20mMpH值为8.3的Tris-HCl、0.005%吐温20和0.5%甘油；所述的试剂C为溶质是柠檬酸钠、枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种的溶液，试剂C的浓度0.1%-0.5%；所述的试剂D为去离子水；所述的试剂E为无乳链球菌cfb基因或含cfb基因的质粒，该试剂E中cfb基因的拷贝数为1×108拷贝/ml；所述的试剂A中引物P1s的序列为：5’-TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3’，引物P1a的序列为5’-CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3’；所述的试剂B中引物P2s的序列为：5’-ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG-3’，引物P2a的序列为5’-CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC-3’。一．本专利技术之一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒的使用方法：1．绘制标准反应对照表：1.1．第一轮PCR反应：取一定量的试剂D和试剂E混合，配制成cfb基因拷贝数分别为2×107拷贝/ml、2×106拷贝/ml、2×105拷贝/ml、2×104拷贝/ml、2×103拷贝/ml、2×102拷贝/ml、0拷贝/ml的cfb基因溶液。抽取健康罗非鱼新鲜血液，立即与试剂C按1:1的比例混合均匀。再与上述的cfb基因溶液分别等体积混合得到混合溶液。分别吸取上述混合溶液1μl作为模板，分别与12.5μl试剂A和11.5μl的去离子水混合，制成总体积为25μl的PCR反应液，进行第一轮PCR反应，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s。反应过程中，在反应条件为94℃变性30s、50℃退火30s和72℃延伸30s时进行循环反应，循环次数为25-35次。将该PCR反应液共制备3份进行PCR反应，除每份PCR反应液的循环次数分别为25，30，35外，其他条件均相同。1.2．第二轮PCR反应：吸取第一轮PCR反应后的PCR反应液1μl，分别与12.5μl试剂B和11.5μl的去离子水混合，制成总体积为25μl的PCR反应液，进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s。反应过程中，在反应条件为94℃变性30s、50℃退火30s和72℃延伸30s时进行循环反应，循环次数为25次。1.3．电泳并绘制标准反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和试剂E；所述的试剂A的组成成分为：引物P1s?0.4?μM；引物P1a?0.4?μM；DNA聚合酶0.1U/μl；dATP、dCTP、dTTP和dGTP各500μM；MgCl?3mM；KCl?100mM，Tris?HCl(pH8.3)?20mM；吐温20?0.005%；甘油0.5%；?所述的试剂B的组成成分为：引物P2s?0.4?μM；引物P2a?0.4?μM；DNA聚合酶0.1U/μl；dATP、dCTP、dTTP和dGTP各500μM；MgCl?3mM；KCl?100mM，Tris?HCl(pH8.3)?20mM；吐温20?0.005%；甘油0.5%；所述的试剂C为溶质是柠檬酸钠、枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种的溶液，试剂C的浓度0.1%?0.5%；所述的试剂D为去离子水；所述的试剂E为无乳链球菌cfb基因或含cfb基因的质粒，该试剂E中cfb基因的拷贝数为1×108拷贝/ml；所述的试剂A中引物P1s的序列为：5’??TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA?3’，引物P1a的序列为5’??CGACAGCATCACACGAAAAATACA?3’；所述的试剂B中引物P2s的序列为：5’??ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG??3’，引物P2a的序列为5’??CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC??3’。...

【技术特征摘要】
1.一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和试剂E；所述的试剂A的组成成分为：引物P1s0.4μM；引物P1a0.4μM；DNA聚合酶0.1U/μl；dATP、dCTP、dTTP和dGTP各500μM；MgCl23mM；KCl100mM，pH值为8.3的Tris-HCl20mM；吐温200.005%；甘油0.5%；所述的试剂B的组成成分为：引物P2s0.4μM；引物P2a0.4μM；DNA聚合酶0.1U/μl；dATP、dCTP、dTTP和dGTP各500μM；MgCl23mM；KCl100mM，pH值为8.3的Tris-HCl20mM；吐温200.005%；甘油0.5%；所述的试剂C为溶质是柠檬酸钠、枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种的溶液，试剂C的浓度0.1%-0.5%；所述的试剂D为去离子水；所述的试剂E为无乳链球菌cfb基因或含cfb基因的质粒，该试剂E中cfb基因的拷贝数为1×108拷贝/ml；所述的试剂A中引物P1s的序列为：5’-TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3’，引物P1a的序列为5’-CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3’；所述的试剂B中引物P2s的序列为：5’-ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG-3’，引物P2a的序列为5’-CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC-3’；所述罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：1．绘制标准反应对照表：1.1．第一轮PCR反应：取一定量的试剂D和试剂E混合，配制成cfb基因拷贝数分别为2×107拷贝/ml、2×106拷贝/ml、2×105拷贝/ml、2×104拷贝/ml、2×103拷贝/ml、2×102拷贝/ml、0拷贝/ml的cfb基因溶液；抽取健康罗非鱼新鲜血液，立即与试剂C按1:1的比例混合均匀，再与上述的cfb基因溶液分别等体积混合得到混合溶液；分别吸取上述混合溶液1μl作为模板，分别与12.5μl试剂A和11.5μl的去离子水混合，制成总体积为25μl的PCR反应液，进行第一轮PCR反应，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s；反应过程中，在反应条件为94℃变性30s、50℃退火30s和72℃延伸...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎娅，罗福广，黄杰，易弋，伍时华，
申请(专利权)人：广西科技大学，
类型：发明
国别省市：