特异性抗rHAP单克隆抗体及其制备方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种特异性抗rHAP单克隆抗体及其制备方法和试剂盒，该特异性抗rHAP单克隆抗体的制备方法具有以下步骤：①免疫；②细胞融合；③阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株；④对步骤③得到的抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株进行特异性阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株。⑤用步骤④得到的特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株制备特异性抗rHAP单克隆抗体。本发明专利技术的特异性抗rHAP单克隆抗体用于制备体内药物浓度检测试剂盒，进而可以检测出rHAP在动物体内的分布情况，增强了检验的特异性和结果的准确性。

【技术实现步骤摘要】
特异性抗rHAP单克隆抗体及其制备方法和试剂盒
本专利技术属于免疫学
，具体涉及一种特异性抗rHAP单克隆抗体及其制备方法和试剂盒。
技术介绍
与小分子药物在动物体内的药物代谢动力学研究不同的是，大分子药物需要特异性更强的检测方法。双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，主要适于大分子抗原，其原理是将已知抗体包被微量反应板后与待检抗原反应，然后再加酶标抗体和底物，根据显色反应对抗原进行定性和定量。在包被抗体和检测抗体的选择上需要对所检测的抗原进行具体分析。重组人抗血栓蛋白(rHAP)系经工程菌发酵表达的重组DNA制品，它是一种以活化血小板为靶点，将分子聚集在血栓部位，并通过其分子中各主要结构域行使发挥比之更高效的抗血栓功能，达到全面、高效抗血栓作用的重组蛋白质药物，同时其靶向性也赋予了该药物较高的安全性。中国专利文献CN1286262A公开的人胎盘抗凝蛋白介导的新型抗凝蛋白即为重组人抗血栓蛋白，它是将不同蛋白质结构域连接在一起构建成的融合蛋白，其分子两端分别为AnnexinV结构域和水蛭素片段结构域。由于Annexin V存在于多种动物体内，因此在进行药物代谢动力学研究时，所用的动物体内的Annexin V会对进入其体内的rHAP检测造成干扰，出现假阳性结果。因此，为了最大程度地降低干扰，同时检测到rHAP分子两端的Annexin V结构域和水蛭素片段结构域，从而满足药物代谢动力学研究的需要，需要制备出针对Annexin V和水蛭素片段抗原决定簇的单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于解决上述问题，提供一种用于检测rHAP在动物体内分布情况的特异性抗rHAP单克隆抗体及其制备方法。本专利技术的目的之二在于解决上述问题，提供一种用于检测rHAP在动物体内分布情况的试剂盒。实现本专利技术目的之一的技术方案是:一种特异性抗rHAP单克隆抗体的制备方法，具有以下步骤:①免疫:分为三次，前两次是将抗原rHAP与弗式完全佐剂制成油包水乳剂，在小鼠颈背部皮下多点注射；第三次是将抗原rHAP用生理盐水溶解，在小鼠腹腔注射。②细胞融合:包括常规方法进行细胞融合、HAT选择性培养以及ELISA法筛选，得到杂交瘤细胞。③对步骤②得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株。④对步骤③得到的抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株进行特异性阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株。⑤用步骤④得到的特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株按照常规方法制备腹水、纯化，得到特异性抗rHAP单克隆抗体。上述步骤④中所述的特异性阳性克隆的筛选是指分别采用rHAP —端的水蛭素片段(其氨基酸序列为:pkpqshndgdfeeipeeylq)和rHAP另一端的Annexin V (其氨基酸序列为:aqvlrgtvt dfpgfderad aetlrkamkg lgtdeesilt lltsrsnaqr qeisaafktl fgrdllddlkseltgkfekl ivalmkpsrl ydayelkhal kgagtnekvl teiiasrtpe elraikqvye eeygssleddvvgdtsgyyq rmlvvllqan rdpdagidea qveqdaqalf qagelkwgtd eekfitifgt rsvshlrkvfdkymtisgfq ieetidrets gnleqlllav vksirsipay laetlyyamk gagtddhtli rvmvsrseidlfnirkefrk nfatslysmi kgdtsgdykk allllcgedd)作为抗原决定簇对抗 rHAP 单克隆抗体杂交瘤细胞株进行阳性克隆的筛选，最后分别得到作为特异性抗rHAP单克隆抗体的抗水蛭素片段单克隆抗体和抗Annexin V单克隆抗体。实现本专利技术目的之二的技术方案是:一种含有上述特异性抗rHAP单克隆抗体的试剂盒，包括包被抗体(上述特异性抗rHAP单克隆抗体其中一种)、检测抗体(上述特异性抗rHAP单克隆抗体另一种)、SAV-HRP, PSB缓冲液以及封闭液。其中封闭液由BSA、蔗糖以及PBS缓冲液组成。检测抗体在应用前需要进行生物素化。上述试剂盒在加样前需按每100 μ L的标准品或待测样品加IOyL浓度为0.4Μ的EDTA混匀后再加入96孔板中。本专利技术具有的积极效果:本专利技术的特异性抗rHAP单克隆抗体用于制备体内药物浓度检测试剂盒，进而可以检测出rHAP在动物体内的分布情况，增强了检验的特异性，大大减少动物体内Annexin V本底的干扰，增强了检验结果的准确性。【具体实施方式】(实施例1)本实施例的特异性抗rHAP单克隆抗体的制备方法具有以下步骤:①免疫:第一次免疫:取40μ g/mouse纯化好的抗原(即rHAP，下同)，加等量的弗氏完全佐齐U，制成油包水乳剂，在小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫:重复第一次免疫。第三次免疫:取40 μ g/mouse纯化好的rHAP，用生理盐水溶解，在小鼠腹腔注射。②细胞融合:a)、SP2/0细胞的制备:融合前4?7天复苏SP2/0细胞，并在含有10% (Mfi)FBS的RPM1-1640培养基中传代培养至所需数量(本实施例为2X 107)。必须保证融合时SP2/0的数量级处于对数生长状态。b)、冲击免疫:在融合前3天取40 μ g/mouse纯化好的rHAP在小鼠腹腔注射进行冲击免疫。c)、制备滋养细胞:在融合前I天取小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞板。断髓处死小鼠，将小鼠浸泡于75% (重量)酒精中消毒3分钟。将小鼠移入超净台，腹部向上放置，剪开腹部皮肤，钝性剥离充分暴露腹膜。剪开腹膜，吸取2?5mL无血清培养基注入腹腔冲洗2?3遍，将培养基吸入离心管中。1200rpm离心7分钟，弃上清，将细胞移入适量完全培养基混匀，制备5块滋养细胞板。将滋养细胞悬液加入96孔板。将96孔板放入37°C孵箱，24小时后使用。d)、细胞融合:将ImL的PEG和20mL无血清RPM1-1640置于37°C孵箱预热。将处于对数生长期的SP2/0细胞收集到50mL离心管中，计数，取2 X IO7个骨髓瘤细胞，1200rpm离心6分钟，弃上清，加入50mL无血清RPM1-1640，洗涤2次。将效价已达到要求，已冲击免疫的免疫小鼠摘眼球放血(收集血清留做阳性对照)，断髓处死，浸泡于75% (重量)酒精中消毒2?3分钟，无菌剪开腹腔，暴露腹膜，取出脾脏，放入平皿中，将脾脏置于200目钢网上，加少量RPM1-1640，研磨，制成单个脾细胞悬液，将脾细胞悬液移入50mL离心管中，加RPM1-1640至50mL，1200rpm离心洗涤2遍。骨髓瘤细胞和脾细胞充分混合，加RPM1-1640，1300rpm离心8分钟，倒尽上清。缓缓加入ImlL的37°C预热的PEG，在60秒加完，作用60秒。向融合体系中加入无血清培养基20mL以终止PEG的作用，先慢后快，第一个ImL加2分钟，第二个ImL加I分钟,其余18mL在3分钟内加完。IOOOrpm离心6分钟,弃上清,加入25mL的含有20% (重量)FBS的RPM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性抗rHAP单克隆抗体的制备方法，具有以下步骤：①免疫，采用的抗原为rHAP；②细胞融合，得到杂交瘤细胞；③对步骤②得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株；④对步骤③得到的抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株进行特异性阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株；⑤用步骤④得到的特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株制得特异性抗rHAP单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种特异性抗rHAP单克隆抗体的制备方法，具有以下步骤: ①免疫，采用的抗原为rHAP； ②细胞融合，得到杂交瘤细胞； ③对步骤②得到的杂交瘤细胞进行阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株； ④对步骤③得到的抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株进行特异性阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株； ⑤用步骤④得到的特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株制得特异性抗rHAP单克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦利军，薛宇醒，吴海燕，庄丽敏，
申请(专利权)人：常州千红生化制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32