本发明专利技术公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，试剂盒中包括用于扩增美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因的两对引物，并提供了检测试剂盒的使用方法。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，较经典的病毒分离、单RT-PCR和血清型分型方法快捷，可以方便地一次性鉴定并区分出属于欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒中的任意一种，以便于对疫病情况及区域、环境做出及时快捷的反应，以最短的时间做出正确的处理办法，同时，本发明专利技术采取的提取全基因组RNA提取的Trizol法具有快速、简单、成本低和所需试剂少的特点，特别适于小样品的提取，具有广泛的市场应用前景。
【技术实现步骤摘要】
—种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及畜类病毒检测试剂盒，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus, PRRSV)引起的，以妊娠母猪发生早产、流产、死胎、弱仔和木乃伊胎，仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病，生产性能降低，饲料报酬率降低，死亡率升高等临。 尽管目前国内外对PRRSV的病原学、血清分型、诊断做了大量的研究，但由于其几乎遍及世界各地，对全世界猪及相关产品的威胁众所周知，它的发病率和造成的经济每年至少为上百亿美元。尤其其与它繁殖与呼吸综合征在临床上很难区分，同时在临床症状和病理变化因感染动物的种类、年龄、病程长短及感染毒株毒力等不同而有所差别，可能缺乏特征病症，这给猪繁殖与呼吸综合征的诊断和防治带来极大困难。因此，单靠临床诊断难以定性。快速简单的实验室诊断方法是确诊猪繁殖与呼吸综合征唯一有效地途径。为了确定猪繁殖与呼吸综合征是否在某一地区存在，检测动物血清抗体的方法并非完全可靠，还必须通过通过病原学检测以确诊病原的存在，一般检测方法为生物学实验、血清型诊断技术和分子生物学技术等诊断技术，但是这些方法有的敏感性不高、有的特异性不强、有的检出率较低，检测周期太长，并且这些技术普遍费用太高。随着2006年第一例欧洲型猪繁殖与呼吸综合征在我国检出，建立一种快速诊断欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的多重RT-PCR试剂盒，完成对PRRS的快速诊断以及对其进行严格监控具有重要意义。·
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种能够快速、简便、灵敏和经济的区分动物所感染的欧洲型或美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为:一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒,所述试剂盒中包括有混合酶Enzyme Mix、2XBuffer 2、无菌双蒸水和两对引物，两对引物分别为用于扩增美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因的引物对一和用于扩增欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的目的基因的引物对二； 所述引物对一包括 上游引物:5' -CACCACGTCGAAAGTGCCGC-3' (SEQ ID NO:1)和 下游引物:5' -GACGCCGGACGACAAATGCG-3' (SEQ ID NO:2)； 所述引物对二包括上游引物:5' -GGGGCTGTTGCACATCCTAA-3' (SEQ ID NO:3 )和 下游引物:5' -ACAAAAGGGCAACAACAGCC-3' (SEQ ID NO:4)； 所述混合酶Enzyme Mix为2μ1, 2 X Buffer为25μ1,无菌双蒸水为50μ1 ； 所述2XBufTer由Tris-盐酸、氯化钾、硫酸镁、硫酸铵、吐温_20和三磷酸脱氧核苷酸dNTPS组成。进一步的，以提取的检测样品的RNA为模板，上述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，在50μ1反应体系中加入检测样品的RNA各3 μ?，EnzymeMix 2 μ?, 2XBuffer 25μ1，10Mmol/L的所述引物对一和引物对二的使用量分别为0.8μ1，然后加无菌的双蒸水至50μ1，其中所述的2XB uffer是由Tris_HCl、KCl、MgS04、(NH4)2S04、Tween-20 和 dNTPS 组成的。本专利技术的第二个目的是提供了一种根据上述猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒在检测欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。进一步的，上述的应用，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒的使用方法为:从待检动物的血液或病死动物的组织中提取其全基因组RNA，以RNA为模板，以试剂盒中的特异性欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒的引物进行多重RT-PCR，对得到的产物进行电泳，根据电泳图谱分析被检动物是否感染有欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒。进一步的，上述的应用，所述待检动物的血液或病死动物的组织的处理方式为用生理盐水稀释或研磨成1:5的乳悬液，全基因组RNA提取的方法采用Trizol法。进一步的，上述的应用，所述RT-PCR反应程序为50°C 30min,94°C 2min，循环程序为 94°C 30s, 58°C lmin,72°C 50s，共 35 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。本专利技术的有益效果为:本专利技术提供的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，较经典的病毒分离、单RT-PCR和血清型分型方法快捷，可以方便地一次性鉴定并区分出属于欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒中的任意一种，以便于对疫病情况及区域、环境做出及时快捷的反应，以最短的时间做出正确的处理办法，这对及时扑灭或阻断传染病的传播具有积极的意义，同时，本专利技术采取的提取全基因组RNA提取的Trizol法具有快速、简单、成本低和所需试剂少的特点，特别适于小样品的提取，本专利技术具有广泛的市场应用前景。【附图说明】图1为利用本专利技术提供的试剂盒检测标准样品的检测结果电泳图。其中，从左至右依次为:M，DNA分子量标准DL-2000 (marker条带的大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp);泳道I为欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测结果；泳道2为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR检测结果；泳道3为欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR检测结果；泳道4为阴性对照。图2本专利技术提供的试剂盒的敏感性试验结果电泳图。其中，从左至右依次为:M, DNA分子量标准DL-2000 (marker条带的大小依次为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp)；泳道 1-5 分别为 4.0XlO5 拷贝的 RNA、4.0X IO4 拷贝的 RNA、4.0 X IO3 拷贝的 RNA、4.0 X IO2 拷贝的 RNA 和 4.0 X IO1 拷贝的 RNA。图3为本专利技术提供的试剂盒的特异性试验结果电泳图。其中，从左至右依次为:M，DNA分子量标准DL-2000 (marker条带的大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp);泳道I为建立的欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测结果；泳道2为建立的欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测结果检测猪圆环病毒-2型病毒的结果；泳道3为建立的欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测猪细小病毒结果；泳道4欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测猪伪狂犬病毒结果；泳道5为欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测结果O型口蹄疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT?PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括有混合酶Enzyme?Mix、2×Buffer?2、无菌双蒸水和两对引物，两对引物分别为用于扩增美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因的引物对一和用于扩增欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的目的基因的引物对二；所述引物对一包括上游引物：5′?CACCACGTCGAAAGTGCCGC?3′和下游引物：5′?GACGCCGGACGACAAATGCG?3′；所述引物对二包括上游引物：5′?GGGGCTGTTGCACATCCTAA?3′和下游引物：5′?ACAAAAGGGCAACAACAGCC?3′；所述混合酶Enzyme?Mix为2μl，2×Buffer为25μl，无菌双蒸水为50μl；所述2×Buffer由Tris?盐酸、氯化钾、硫酸镁、硫酸铵、吐温?20和三磷酸脱氧核苷酸dNTPS组成。
【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括有混合酶Enzyme Mix,2XBuffer 2、无菌双蒸水和两对引物，两对引物分别为用于扩增美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因的引物对一和用于扩增欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的目的基因的引物对二； 所述引物对一包括 上游引物:5' -CACCACGTCGAAAGTGCCGC-3'和 下游引物:5' -GACGCCGGACGACAAATGCG-3'； 所述引物对二包括 上游引物:5' -GGGGCTGTTGCACATCCTAA-3'和 下游引物:5' -ACAAAAGGGCAACAACAGCC-3'；所述混合酶Enzyme Mix为2Pl,2XBuffer为25μ1,无菌双蒸水为50μ1 ； 所述2XBufTer由Tris-盐酸、氯化钾、硫酸镁、...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘永生，丁耀忠，张杰，周建华，陈豪泰，马丽娜，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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