本发明专利技术涉及一种新的严重急性呼吸道综合症冠状病毒Ｘ４蛋白及其片段，编码该蛋白及其片段的核苷酸序列，以及该蛋白及其片段的特异性单克隆抗体和多克隆抗体。本发明专利技术还涉及一种体外检测严重急性呼吸道综合症的方法，其为体外检测待测样品中本发明专利技术的Ｘ４蛋白或其片段，和／或体外检测本发明专利技术Ｘ４蛋白或其片段的特异性抗体。本发明专利技术进一步提供一种试剂盒，其含有本发明专利技术Ｘ４蛋白或其片段，和／或本发明专利技术Ｘ４蛋白或其片段的特异性抗体。本发明专利技术对于ＳＡＲＳ的诊断、治疗以及发病机理的研究提供了新的思路。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒蛋白及其抗体，具体的说，本专利技术涉及一种新的严重急性呼吸道综合症冠状病毒蛋白或其片段，编码该蛋白或其片段的核苷酸序列，以及该蛋白或其片段的特异性抗体和应用。
技术介绍
严重急性呼吸道综合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)为严重呼吸道传染疾病，它有急性发病，早期出现肺部病变，死亡率高等特点，临床主要表现为肺炎，典型症状为发高烧(＞38℃)、干咳、呼吸急促或呼吸困难，死亡率约为5％-7％。SARS病患，中国人称之为“非典”，已经成为严重危害人类健康的世界性问题。世界卫生组织确认一种新型的冠状病毒为SARS的病原体，并将之命名为SARS病毒。SARS病毒为正链的单链RNA病毒，复制不经过DNA中间体，使用标准密码子。目前，对于SARS病毒除了有已知蛋白如P、S、M、E、N等之外，至少还编码预测的5个开放读码框架(ORF)，分别命名为X1-X5(Rota PA，ObersteMS，Monroe SS等，严重急性呼吸道综合症相关冠状病毒的特性描述(Characterization of a novel coronavirus associated with severe acuterespiratory syndrome，Science 2003；300(5624)1394-1399)或ORF3，4，7，8，11(Marra MA，Jones SJ，Astell CR等SARS相关冠状病毒的基因组序列(The Genome sequence of the-associated coronavirus)Science2003；300(5624)1399-1404)。但是对于这些蛋白是否存在、是否能进一步分离获得和对于病毒感染的意义目前尚无任何报道。目前，尽管有一些关于SARS的早期实验室诊断技术，但其仍然存在问题，特异性高的免疫检测技术只能检测病人的抗病毒结构蛋白抗体，由于其出现时间晚，发病10-14天以前的病人难以测出，使患者的及时隔离造成困难。敏感性较高的PCR技术虽然能在发病4天检测出病毒RNA，但由于存在假阳性和假阴性的问题，其诊断的特异性仍有疑问。目前迫切需要开发和研制高特异性的早期诊断方法及试剂，特别是免疫检测方法及试剂。在SARS的发病机理研究方面，目前也尚存在许多疑问，特别是急性期病人出现的间质性肺炎，推测自身免疫病理损伤可能发挥重要作用，但仍缺乏实验证据和分子机理研究。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种分离的蛋白，该蛋白包含如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或其片段。如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列(genebank登记号NP-828857)为本专利技术所述严重急性呼吸道综合症冠状病毒X4蛋白的全长氨基酸序列，含有122个氨基酸，计算机分析发现它1-17位氨基酸含有信号肽序列，101-117位氨基酸含有跨膜区序列，属于I型膜蛋白。基序扫描(Motif Scan)分析发现118-121位氨基酸含有潜在的cAMP-依赖性和cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点；83-85和116-118位氨基酸含有潜在的PKC磷酸化位点；5-15位和57-67位氨基酸含有潜在的原核膜脂蛋白脂质体结合位点(Prokaryoticmembrane lipoprotein lipid attachment site)；38-43和70-75位氨基酸含有潜在的N-豆蔻酰化位点。同源比较分析证明X4蛋白与粘附分子L-选择素(L-Selectin，CD62L)在氨基酸序列上有26.2％的同源性。针对目前尚无任何资料报道X4蛋白是否存在、能否获得分离的X4蛋白和对于病毒感染的意义的现状，本专利技术以实验证明了SARS病人血清能测出抗X4蛋白的抗体(参见实施例3和4)，SASR病毒转染的真核细胞膜上表达X4蛋白(参见实施例6)，证明了X4蛋白的表达和客观存在。在此基础上，并进一步分离和获得了X4蛋白。进一步的功能研究证明重组X4蛋白能抑制Balb/C 3T3细胞的生长(参见实施例7)。本专利技术中的X4蛋白片段是指具有部分或全部本专利技术X4蛋白的蛋白，它至少由20个氨基酸组成，优选由40个以上氨基酸组成，所述片段可以与X4蛋白在功能上相同、相似或不同，优选为与其生物学活性基本相同的蛋白。在本专利技术的一个实施方式中，提供一种蛋白片段(重组X4蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列无全长X4蛋白的信号肽、跨膜区和外膜区。由于其保留了X4蛋白的主要编码区(对应于SEQ ID NO2所示的18-100位氨基酸)，其具有与所述全长序列基本相同的生物学活性。重组X4蛋白可以代替全长X4蛋白用于检测X4蛋白的抗体的存在，或用于功能检测，参见实施例1和2。本专利技术以实验证明了SARS病人血清能测出抗X4蛋白的抗体(参见实施例3和4)，SASR病毒转染的真核细胞膜上表达X4蛋白(参见实施例6)，证明了X4蛋白的表达和客观存在。功能研究证明重组X4蛋白能抑制Balb/C 3T3细胞的生长(参见实施例7)。本专利技术的重组蛋白与全长序列相比，不仅功能基本相同，而且可以快速、低成本制备。本专利技术的SARS病毒X4蛋白或其片段可以是天然的、合成的、半合成的、或者重组产生。本专利技术的SARS病毒X4蛋白或其片段可按常规的生物工程方法由宿主细胞中的重组DNA序列编码产生。实施例1和2，是以一个重组X4蛋白作为例子，详细描述了X4蛋白的制备过程，本领域普通技术人员已知，可以用X4蛋白全长序列代替该重组X4蛋白，其余条件按相同或相似条件进行，获得X4蛋白；其它的蛋白片段也可以按相同或相似条件获得。本专利技术的SARS病毒X4蛋白也可按照Steward和Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，PierceChemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用AppliedBiosystem合成仪或PioneerTM肽合成仪按固相化学技术合成，或者可使用衍生于本专利技术的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的蛋白。在本专利技术的一个实施方式中，所述的SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白可由如SEQ ID NO1所示核苷酸序列编码。如SEQ ID NO1所示的序列为分离自SARS病毒基因组的序列。在本专利技术的另一个实施方式中，所述的如SEQ IDNO4所示氨基酸序列的蛋白可由如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列编码。如SEQ ID NO3所示的序列是专利技术人根据X4蛋白的主要编码区设计的核苷酸序列，其适于在大肠杆菌中表达。本领域技术人员已知，可以根据不同的宿主和表达载体，设计编码本专利技术的X4蛋白的多核苷酸。本专利技术的基因，或者各种DNA片段的核苷酸序列可以用常规方法，如双脱氧链终止法(Sanger等人，PNAS，1977，745463-5467)测定。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。本领域普通技术人员已知，本专利技术所述的蛋白可以同其它的蛋白或蛋白形成融合蛋白。其它蛋白或蛋白的编码序列一般是已知的，有些可以以载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的蛋白，该蛋白包含如ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示的氨基酸序列或其片段。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：马大龙，陈英玉，双宝，刘顺爱，韩普，朱仁英，宋泉声，张剑平，
申请(专利权)人：北京大学，北京北医联合生物工程有限公司，北京地坛医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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