本发明专利技术涉及一种顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因、其编码的多肽及其相关应用，所述顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因具有如SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列，由该基因编码的顺式环氧琥珀酸水解酶具有如SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列。用所述顺式环氧琥珀酸水解酶基因构建的原核表达载体转化大肠杆菌构建基因工程菌，该基因工程菌经过诱导后能将顺式环氧琥珀酸或其盐高效率地转化为L(+)-酒石酸或其盐，从该大肠杆菌中获得的顺式环氧琥珀酸水解酶具有将顺式环氧琥珀酸或其盐高效率地转化为L(+)-酒石酸或其盐的能力。
【技术实现步骤摘要】
顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因、其编码的多肽及其相关应用
本专利技术属于微生物基因工程领域，提供了一种新的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因及其编码的多肽，进一步提供了用于编码这种多肽的多核苷酸，用于表达该种多肽的重组表达载体和重组微生物菌株及制备L (+)-酒石酸或其盐的方法。
技术介绍
L(+)_酒石酸[(2R，3R)-2，3-二羟丁烷_1，4 二羟酸]是一种天然结构的有机酸，在某些植物果实如葡萄、罗望子果实中有较高的含量，广泛应用于食品、医药、建筑、化工、纺织、电镀等行 业，其需求量正在逐年递增。过去，生产L(+)_酒石酸的主要方法是从葡萄酒的副产物酒石中提取得到。目前主要利用微生物所分泌表达的顺式环氧琥珀酸水解酶来生产L (+)-酒石酸或其盐:先以顺丁烯二酸酐为原料加水得到顺丁烯二酸，再以钨酸或钨酸盐为催化剂使顺丁烯二酸与过氧化氢反应制得顺式环氧琥珀酸，最后利用顺式环氧琥珀酸水解酶或具有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物将顺式环氧琥珀酸或其盐水解为L(+)_酒石酸或其盐。1974年，佐藤英次等采用酶法合成L(+)_酒石酸，即用化学合成的顺式环氧琥珀酸作为底物，在含有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物作用下，使底物水解为L(+)_酒石酸，而且几乎不产生副产物。1976 年，Kamatani 等在 M.S.M.S.Pat.N0.4028185A、M.S.Pat.N0.4013509A 和M.S.Pat.N0.4011135A中阐述了利用微生物转化顺式环氧琥珀酸生产L(+)-酒石酸的方法，使L (+)-酒石酸的大量生产真正成为可能。目前报道的可以用于生产L(+)_酒石酸或其盐的微生物主要有:无色杆菌属(Achromobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、根瘤菌属(Rhizobium)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和棒状杆菌属(Coryncbacterium)。一般认为，微生物转化法生产L(+)_酒石酸具有酶立体专一性好、酶促反应快、产品光学纯度和产品得率高、产品分离纯化简单易行等特点。但是由于微生物体内固有的酶系统非常复杂，顺式环氧琥珀酸水解酶的表达量不高，其活性也受到胞内胞外多种因素的制约，导致L(+)_酒石酸生产效率低下。利用基因工程技术构建具有顺式环氧琥珀酸水解酶基因的基因工程菌，可以实现顺式环氧琥珀酸水解酶的高效表达，这也成为工业生产L(+)_酒石酸的关键。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于，克服现有的顺式环氧琥珀酸水解酶表达量不高，导致L (+)_酒石酸生产效率低下的缺陷，而提供一种新的顺式环氧琥珀酸水解酶编码基因，所要解决的技术问题是实现由其编码的顺式环氧琥珀酸水解酶的高效表达，进而提高L(+)_酒石酸的生产效率。本专利技术提供了一种顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其核苷酸序列来源于分离纯化的克雷伯氏菌BK-58菌株(Klebsiella sp.BK-58),优选为具有中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号CGMCC N0.4949的克雷伯氏菌BK-58菌株，其拉丁文学名为Klebsiella sp.BK-58，于2011年6月12日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。上述顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列(基因组DNA、cDNA或RNA)，与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有70%以上，优选为80%以上，更优选为90%以上的同源性。具体来说，本专利技术提供的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列可以是SEQID NO:1所示核苷酸序列的等位基因变异体，或者是从其他物种分离得到的核苷酸序列，也可以是SEQ ID NO:1所示核苷酸序列截短、删除、替代或增加一个或整个核苷酸的结果。序列之间的同源性可以用标准的比对方法确定，比如ClustalX。本专利技术的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列是含有全部SEQ IDNO:1所示序列的核苷酸序列或含有部分SEQ ID NO:1所示序列的核苷酸序列。前述的“含有部分SEQ ID NO:1所示序列的核苷酸序列”是指该序列含有超过100个与SEQ ID NO:1所示序列中的核苷酸相同的核苷酸，亦指其编码的氨基酸多肽具有与由全部SEQ ID NO:1所示序列编码的氨基酸多肽(即SEQ ID NO: 2的完整氨基酸序列)相似的顺式环氧琥珀酸水解酶活力。上述“含有部分SEQ ID NO:1所示序列的核苷酸序列”编码的氨基酸多肽具有与由全部SEQ ID NO:1所示序列编码的氨基酸多肽(即SEQ ID NO: 2)相似的顺式环氧琥珀酸水解酶活力，优选具有SEQ ID NO:280%以上的顺式环氧琥珀酸水解酶活力，更优选具有SEQ ID NO:2100%的顺式环氧琥珀酸水解酶活力。本专利技术还提供了一种重组核苷酸序列，其含有前述顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列，且邻接有一个或多个、来源于同源或异源微生物的调控序列。所述的调控序列，其包括选自启动子序列、分泌信号序列、终止信号序列等调控序列中的一种或多种。本专利技术另外提供了一种含有前述顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列的载体，其任选地还包含一个或多个来源于同源或异源微生物的调控序列。所述“载体”系指所有可用于将核苷酸序列转导或转染进入宿主细胞的生物化学构架。本专利技术涉及的载体可为质粒、病毒、噬菌粒、脂质体、阳离子囊泡中的一种或几种。上述载体中可以包含一个或多个前述的调控序列。本专利技术的载体优选为质粒。本专利技术涉及的宿主细胞，优选为一种重组宿主细胞，其由本专利技术所述核苷酸序列或载体经转化而来。前述的“本专利技术所述核苷酸序列或载体经转化而来的宿主细胞”，系指该宿主本身没有前述的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列或载体，而是经过转化后，使得宿主带有该核苷酸序列或载体。上述宿主细胞 能表达前述顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因的核苷酸序列或载体，并且产生前述核苷酸序列或载体编码的氨基酸序列。本专利技术涉及的前述核苷酸序列能整合到所选宿主的基因组中，或以游离型载体的形式存在于前述宿主细胞中。为了便利起见，本专利技术涉及的重组宿主细胞包括微生物，优选为细菌和真菌，包括酵母。上述重组宿主细胞经改造优选后，能高水平地表达顺式环氧琥珀酸水解酶。[0021 ] 上述“高水平地表达”是在前述重组宿主细胞中，通过相邻调控序列控制前述核苷酸序列来实现过量表达。本专利技术另外又提供了一种分离纯化后得到的顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列，其由前述分离纯化后的核苷酸编码，并(或)由前述重组宿主细胞表达。本专利技术的顺式环氧琥珀酸水解酶，其分子量在25_35kDa，优选为约30kDa(理论值为 30.124kDa)。本专利技术的顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列或其多肽由前述重组宿主细胞胞外或胞内表达和(或)分泌表达。本专利技术的顺式环氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有50%以上，优选为70%以上，更优选为90%以上的同源性。本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于:所述编码基因具有如SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于:所述编码基因具有如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于:所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.一种顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于其与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有70%以上的同源性。4.根据权利要求3所述的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于其与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有80%以上的同源性。5.根据权利要求4所述的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于其与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性。6.根据权利要求3所述的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因，其特征在于:所述编码基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:15 或 SEQID NO:19 所示。7.一种多肽，其特征在于其具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。8.一种由权利要求2所述的编码基因编码的多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。9.一种多肽，其特征在于其氨基酸序列是由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过氨基酸的取代、缺失或添加而得，并且具有顺式环氧琥珀酸水解酶活性。10.根据权利要求9所述的多肽，其特征在于其具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的50个以上的氨基酸，其顺式环氧琥珀酸水解酶活力至少为完整氨基酸序列SEQ ID NO:2的80%以上。11.根据权利要求10所述的多肽，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：张建国，谢志鹏，程永青，潘海峰，鲍文娜，
申请(专利权)人：杭州宝晶生物化工有限公司，
类型：发明
国别省市：
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