本发明专利技术涉及一种新型β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其高效异源表达。本发明专利技术还涉及含有所述编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明专利技术还涉及表达编码基因的宿主细胞及其诱导培养条件。本发明专利技术还涉及利用所述β-葡萄糖苷酶将纤维素降解过程中所生成的纤维二糖水解为葡萄糖的方法。本发明专利技术的β-葡萄糖苷酶具有弱酸性条件下稳定性好和活性高的特点，可良好地应用于工业生产。
【技术实现步骤摘要】
—种新的β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其用途
本专利技术属于生物
，涉及一种新的β-葡萄糖苷酶、其编码基因、用途、及其高效异源表达。
技术介绍
纤维素是多个葡萄糖残基以β_1，4-糖苷链连接而成的多聚物，是地球上最丰富的可再生的生物质资源。以木质纤维素为原料、用纤维素酶水解纤维素生成葡萄糖，进而发酵为燃料乙醇成为应对当今世界能源危机、环境污染等问题的重要出路。纤维素酶是指能够将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶(endo- β -1, 4-glucanase, EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase, EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(i3-gluc0SidaSe，EC 3.2.1.21)。内切葡聚糖酶作用于纤维素长链分子的内部将长纤维切成短纤维，外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的一端，以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维二糖，β-葡萄糖苷酶切割纤维二糖及一些纤维寡糖最终生成单个的葡萄糖分子。作为纤维素复合酶系的重要组成之一，β -葡萄糖苷酶的关键作用主要体现在两个方面:一方面，由于纤维二糖积累对其上游内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性具有显著的反馈抑制作用，因此，β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的高效水解能力对纤维素的彻底降解起到至关重要的作用。另一方面，除水解活性，葡萄糖苷酶还具有转糖苷活性，在一定的条件下可以通过转糖苷作用将两个葡萄糖分子合成一个槐糖分子，而已经发现槐糖是纤维素酶基因表达的强诱导物。一般认为丝状真菌中纤维素酶合成的诱导机制是:存在于分生孢子和菌丝表面的少量组成型纤维素酶首先降解纤维素生成纤维二糖等寡糖，然后在质膜结合的葡萄糖苷酶的转糖苷作用下，生成槐糖等诱导物，经细胞膜上的组成型透性酶系统进人细胞内，启动纤维素酶的合成。由此可见，提高β_葡萄糖苷酶在纤维素降解体系的催化活性，对于提高纤维素降解体系转化效率及降低纤维素乙醇产业生产成本，具有巨大的商业价值和现实意义。β -葡萄糖苷酶底物专一性差异很大，除了作用于纤维二糖及纤维糊精而在纤维素产乙醇产业方面发挥重要作用外，还可作用于芳基葡萄糖苷(如熊果甙、水杨苷及生色化合物P-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)、烷基葡萄糖苷(甲基-β-D-葡萄糖苷)及β-1，3-葡萄糖苷(昆布二糖)等。因此在其他领域的应用也非常广泛。例如在食品行业中，由于它能将水果中糖苷前体的芳香族化合物释放变为具有浓郁香味的化合物，从而改善茶叶、果汁和果酒的风味，因此其作为特殊的风味酶已得到广泛应用；在医药保健品行业中，β -葡萄糖苷酶可通过生物转化功能，将某些广泛存在的天然产物转化为在自然界稀有甚至不存在的物质。例如，β -葡萄糖苷酶可将无活性的结合型大豆异黄酮转化为具有生理活性的游离型苷元，进而发挥改善更年期综合症、预防骨质疏松、抗氧化等生物学功能等。葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中许多植物和微生物体内。由于植物来源的 葡萄糖苷酶活性远比微生物来源要低，所以其分离主要集中在微生物上。现有技术中的大部分，尤其是细菌来源的β-葡萄糖苷酶的活力较低，在产量、理化特性、催化效率等方面也远远不能满足现代工业生产的需求。因此在工业生产中研究较多的是曲霉，通过自然选育、诱变育种、原生质体诱变和基因工程手段，人们选育出了众多的高产黑曲霉和米曲霉等菌株并优化了产酶工艺(应用生态学报，1999，1(K6) =732-734 ；Appl.Environ.Microbiol, 1998,64(10):3607-3614)。同时国外一些知名酶制剂公司还利用这些高酶活的β_葡萄糖苷酶在产纤维素酶的工程菌株中进行重组表达，提高了产量(EuropeanPatentEP1225227 ；EP0244234 ;EP0121397)。但是目前工业上β -葡萄糖苷酶产量还是远远不够的，因而有必要进一步扩大筛选对象，从中筛选出酶活较高、理化特性更趋多样化的新的β -葡萄糖苷酶,并进行高效分泌表达来降低工业生产成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的葡萄糖苷酶、其编码基因及其用途。在本专利技术的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组:(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽；(b)具有SEQ ID NO:2中第22-736位所示的氨基酸序列的多肽；(b)将(a)或(b)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)或(b)多肽功能的衍生的多肽；(c)具有(a)或(b)多肽功能的(a)或(b)的多肽的片段(较佳地，其与SEQ IDNO:2的序列相同性高于70% ;更佳地高于75% ;更佳地高于80% ;更佳地高于85% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更·佳地高于98%或99%);或(d)在(a)或(b)多肽的N或C末端具有标签序列，或在(b)多肽的N末端具有信号肽序列的多肽。在一个优选例中,所述的多肽来源于土曲霉(Aspergillus terreus)。在本专利技术的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组:(I)编码所述多肽的多核苷酸；或(2)与多核苷酸(I)互补的多核苷酸。在一个优选例中，该多核苷酸编码如SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽，或编码SEQ ID NO:2中第22-736位所示的氨基酸序列的多肽。在另一优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；或如SEQ IDNO:1中第64-2211位所示。在本专利技术的另一方面，提供一种载体，其含有所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的载体是真核表达载体。在另一优选例中，所述的载体是毕赤酵母表达载体，例如pPIC。在另一优选例中，所述的载体是里氏木霉表达载体，例如骨架载体pHDt/sk。在另一优选例中，所述的载体还含有与所述的多核苷酸操作性连接的启动子，所述的启动子具有SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的宿主细胞为非生殖细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞为里氏木霉和毕赤酵母。在本专利技术的另一方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包含:(i)培养所述的宿主细胞，使之表达(较佳地，诱导其表达)所述的多肽；(ii)收集含有所述的多肽的培养物；和(iii)从培养物中分离出所述的多肽。在本专利技术的另一方面，提供所述的多肽或所述的宿主细胞的培养物的用途，用于水解糖苷键；或用于形成简单糖(如葡萄糖)。在另一优选例中，所述的多肽水解选自(但不限于)下述底物的糖苷键:水杨苷、纤维素、纤维二糖、熊果苷、芳基葡萄糖苷或烷基葡萄糖苷、β_1，4-葡萄糖苷、硝基苯-β -D-半乳糖、β -D-木糖苷、硝基苯_β -吡喃葡萄糖苷、硝基苯_β -盐藻糖苷、海带多糖、地衣多糖、或它们的混合物。在本专利技术的另一方面， 提供一种组合物，它含有所述的多肽或含有所含宿主细胞的培养物；以及食品学或工业上可接受的载体。在另一优选例中，所述的组合物还含有调节酶活性的添加物，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：(a)具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列的多肽；(b)具有SEQ?ID?NO:2中第22?736位所示的氨基酸序列的多肽；(b)将(a)或(b)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)或(b)多肽功能的衍生的多肽；(c)具有(a)或(b)多肽功能的(a)或(b)的多肽的片段；或(d)在(a)或(b)多肽的N或C末端具有标签序列，或在(b)多肽的N末端具有信号肽序列的多肽。
【技术特征摘要】
1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组: (a)具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多肽； (b)具有SEQID NO:2中第22-736位所示的氨基酸序列的多肽； (b)将(a)或(b)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)或(b)多肽功能的衍生的多肽； (C)具有(a)或(b)多肽功能的(a)或(b)的多肽的片段；或(d)在(a)或(b)多肽的N或C末端具有标签序列，或在(b)多肽的N末端具有信号肽序列的多肽。2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组: (1)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；或 (2)与多核苷酸(I)互补的多核苷酸。3.—种载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的多核苷酸。4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，其还含有与权利要求2所述的多核苷酸操作性连接的启动子，所述的启动子具有SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列。5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3或4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。6.—种权利要求1所述的多肽的制备方法,其特征在于,该方法包含: (i)...
【专利技术属性】
技术研发人员：周志华，邹根，严兴，魏维，陈玲，张珺，王成树，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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