设计核酸及其使用方法技术

本发明专利技术提供了递送生物物质(例如修饰的核酸)到细胞以调节蛋白质表达的组合物和方法。所述组合物和方法包括使用修饰的信使RNA，且可用于生产蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供了递送生物物质(例如修饰的核酸)到细胞以调节蛋白质表达的组合物和方法。所述组合物和方法包括使用修饰的信使RNA，且可用于生产蛋白质。【专利说明】相关申请的交叉引用本申请要求2010年10月I日提交的美国临时申请61/404，413的优先权，其公开的内容视为本申请公开内容的一部分(并在此通过引用而全文引入)。
技术介绍
天然存在的RNA是由四种基本的核糖核苷酸ATP、CTP、UTP和GTP合成的，但也可以含有转录后修饰的核苷酸。而且，在RNA中已经鉴定出大约100种不同的核苷修饰(Rozenski,J,Crain,P,和 McCloskey, J(1999)。RNA 修饰数据库:1999 年更新,Nucl AcidsRes 27:196-197)。但是，在免疫刺激潜能和RNA翻译效率方面，核苷修饰所起的作用尚不明了。影响蛋白质表达的现有方法学中存在许多问题。例如，引入细胞的异源DNA (不论异源DNA是否整合入染色体)可能由子代或后代细胞遗传。引入的DNA可以以某种频率整合入宿主细胞的基因组DNA，从而改变和/或破坏宿主细胞的基因组DNA。此外，在产生蛋白质之前必须经过多个步骤。一旦进入细胞，DNA必须转运到细胞核中，在细胞核内转录成RNA。之后从DNA转录的RNA必须进入细胞质，在细胞质内翻译成蛋白质。对多个处理步骤的需求导致了在感兴趣的蛋白质产生之前的时间延滞。此外，在细胞内实现DNA的表达存在困难；经常地，DNA进入细胞但没有表达，或者没有以合理的速度或浓度表达。将DNA引入诸如原代细胞或修饰的细胞系的细胞时，这可能尤其是个问题。本领域需要解决核调节酸细胞内翻译的生物学模式。除非另有解释，否则在本文中使用的所有技术和科学术语与本专利技术所属
普通技术人员通常的理解具 有相同的含义。尽管，类似于或等同于本文所述的方法和材料也可用于本专利技术的实施和检测，但在此描述了适合的方法与材料。材料、方法和实施例仅为示例性的，而非旨在限制。本专利技术其他特征可以自以下专利技术详述和权利要求明显看出。专利技术简述本文描述了生产蛋白质、多肽和肽的方法。例如，所述方法包括在所述感兴趣的蛋白质、多肽或肽在细胞内产生(例如，翻译)的条件下，将编码感兴趣的蛋白质、多肽或肽的核酸(例如，本文所述的修饰核酸)引入细胞(例如，人细胞)。在一些【具体实施方式】中，所述核酸包含一个或多个核苷修饰(例如，一个或多个本文所述的核苷修饰)。在一些【具体实施方式】中，所述核酸能逃脱该核酸所引入的细胞的天然免疫反应。在一些【具体实施方式】中，所述蛋白质、多肽或肽是本文所述的治疗性蛋白质。在一些【具体实施方式】中，所述蛋白质、多肽或肽包含一个或多个翻译后修饰(例如，人细胞中存在的翻译后修饰)。本文还描述了用以生产蛋白质的组合物和试剂盒。本文进一步描述了具有(例如，通过本文所述的方法产生的)改变的蛋白质水平的细胞和培养物。一方面，本专利技术涉及在细胞内生产感兴趣的蛋白质(例如，异源蛋白质)的方法，所述方法包括步骤:(i )提供能进行蛋白质翻译的靶细胞；以及(? )在所述感兴趣的蛋白质在靶细胞内生产的条件下，向靶细胞内引入包含第一分离的核酸的组合物，所述第一分离的核酸包含编码感兴趣的蛋白质的可翻译区和核苷修饰。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从细胞中充分纯化感兴趣的蛋白质的步骤。在一些实施方式中，所述感兴趣的蛋白质是分泌蛋白。另一方面，本专利技术涉及在细胞内生产感兴趣的蛋白质(例如，异源蛋白质)的方法，所述方法包括步骤:(i )提供能进行蛋白质翻译的靶细胞，以及(ii )在所述感兴趣的蛋白质在细胞内产生的条件下，向靶细胞内引入组合物，所述组合物包含:(a)包含编码感兴趣的蛋白质的可翻译区和核苷修饰的第一分离的核酸；和(b)包含抑制性核酸的第二核酸。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从细胞中充分纯化感兴趣的蛋白质的步骤。在一些【具体实施方式】中，所述感兴趣的蛋白质是分泌蛋白。一方面，本专利技术涉及提高细胞内感兴趣的重组表达蛋白质的产量的方法，包括步骤:(i )提供包含编码感兴趣的蛋白质的重组核酸的靶细胞；和(ii )在效应蛋白(effector protein)在祀细胞内生产的条件下，向祀细胞引入含有第一分离的核酸的组合物，从而提高细胞内重组表达蛋白的产量，所述第一分离的核酸包含编码翻译效应蛋白的可翻译区和核苷修饰。在一些具体实施方 式中，所述靶细胞是哺乳动物细胞。在一些【具体实施方式】中，所述靶细胞是酵母细胞。在一些【具体实施方式】中，所述靶细胞是细菌细胞、昆虫细胞或植物细胞。在一些【具体实施方式】中，所述感兴趣的蛋白质是分泌蛋白质。在一些【具体实施方式】中，所述感兴趣的蛋白质是跨膜蛋白。在一些【具体实施方式】中，所述感兴趣的蛋白质是抗体或其抗原结合片段。在一些【具体实施方式】中，所述感兴趣的蛋白质是生长因子或细胞因子。在一些【具体实施方式】中，所述感兴趣的蛋白质是肽或肽类似物。在一些【具体实施方式】中，所述翻译效应蛋白是神经酰胺转移蛋白(CERT)。在一些【具体实施方式】中，在靶细胞中以有效提高重组表达蛋白质翻译效率的量翻译所述翻译效应蛋白。在一些【具体实施方式】中，在靶细胞中以有效减少细胞内除了重组表达蛋白质以外的蛋白质的翻译效率的量翻译所述翻译效应蛋白。在一些【具体实施方式】中，在靶细胞中以有效减少含有重组表达蛋白质的包涵体的形成的量翻译所述翻译效应蛋白。在一些【具体实施方式】中，在靶细胞中以有效减少细胞内重组表达蛋白质的降解的量翻译所述翻译效应蛋白。在一些【具体实施方式】中，在靶细胞中以有效增加重组表达蛋白质的分泌的量翻译所述翻译效应蛋白。另一方面，本专利技术涉及用以改变靶细胞中感兴趣的蛋白质的水平的方法，所述方法包括步骤:(i )调节靶细胞内的至少一种翻译效应分子的活性；以及(? )培养所述细胞。在一些【具体实施方式】中，所述靶细胞不包含重组核酸。在一些【具体实施方式】中，所述方法进一步包括分离感兴趣的蛋白质的步骤。另一方面，本专利技术涉及用以调整靶细胞内感兴趣的蛋白质水平的方法，包括步骤:i )调节靶细胞内至少一种翻译效应分子的活性，其中所述调节包括向靶细胞中引入含有编码翻译效应蛋白的可翻译区和核苷修饰的第一分离的核酸；以及ii )培养所述细胞。一方面，本专利技术涉及一种具有改变了的蛋白质水平的动物细胞(例如，哺乳动物细胞)，其通过下述步骤产生:(i )向细胞内引入有效量的含有编码翻译效应蛋白的可翻译区和核苷修饰的第一分离的核酸；以及(? )培养所述细胞。在某些实施方式中，引入细胞的第一分离的核酸的有效量通过滴定由可翻译区翻译的蛋白质的预期量确定。一方面，本专利技术涉及含有大量本专利技术所述细胞的高密度培养物。在一些【具体实施方式】中，所述培养包括分批补料过程。在一些【具体实施方式】中，所述培养包括连续给料过程。一方面，本专利技术涉及用于蛋白质生产的组合物，所述组合物包含含有可翻译区和核苷修饰的第一分离的核酸，以及适合第一核酸的可翻译区翻译的哺乳动物细胞，其中所述核酸显示出减少的由细胞核酸酶引起的降解。在一些【具体实施方式】中，所述哺乳动物细胞含有重组核酸。另一方面，本专利技术涉及用于蛋白质生产的组合物，所述组合物包含:(i )含有可翻译区和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾森·施伦，格雷戈里·J·西兹克维克兹，凯内齐·伊杰贝，萨伊达·尔巴施尔，
申请(专利权)人：现代治疗公司，
类型：
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