增强造血干细胞移入的方法技术

本发明专利技术提供一种通过离体预处理增强造血干细胞移入的新方法，所述方法包括下述步骤：获得包含造血干细胞的样品并且与前列环素类似物混合得到混合物，将所述混合物温育足以在所述细胞中刺激Gαs-信号传导的一段时间，和任选地分离所述被刺激过的细胞。此外，本发明专利技术提供一种包含前列环素类似物的组合物，其用于进行造血干细胞移植的个体的治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增强造血干细胞移入的方法本专利技术提供一种通过离体预处理增强造血干细胞的移入的新方法，所述方法包括下述步骤：获得包含造血干细胞的样品并且与前列环素类似物混合得到混合物，将所述混合物温育一段时间，所述时间足以在所述细胞中刺激Gαs-信号传导，和任选地分离所述被刺激过的细胞。此外，本专利技术提供一种包含曲前列尼(Treprostinil)的组合物，其用于进行造血干细胞移植的个体的治疗。造血干细胞(HSCs)是原始细胞，能够产生在个体的一生中所有血液产物、平衡其自我更新与后代分化。HSCs在发育过程中位置转移，并且在哺乳动物的整个生命中循环，进入并流出血流从而在归巢(homing)、移入(engraftment)和保持(retention)的连续步骤中结合骨髓生态位(bonemarrowniches)。归巢是供体干细胞找到进入骨髓的路径的过程，干细胞的移入意指其在骨髓中的生长。造血干细胞由于其在移植物接受体中恢复血细胞和免疫细胞的能力而具有治疗潜力。此外，HSCs具有产生其他组织如脑、肌肉和肝脏的细胞的潜力。人自体和异体骨髓移植方法目前用作疾病诸如白血病、淋巴瘤和其他威胁生命的疾病的疗法。对于这些方法，必须分离大量的供体骨髓，以确保存在足够的HSCs用于移入。造血干细胞在体内需要Gαs-转导的信号以定殖于骨髓生态位(1)。这些最近的发现证实了较早期的体外实验，其表明Gαs的激活促进造血干细胞的存活和分化(2，3)。Gαs是异三聚体G蛋白的结合鸟嘌呤核苷酸的α-亚基，其刺激膜结合的哺乳动物腺苷酸环化酶的所有9种同种型。通过用霍乱毒素处理细胞可以离体/体外组成型激活Gαs，原因在于霍乱毒素APD-核糖基化催化的鸟嘌呤残基(R186/187/201/202，精氨酸的精确数目取决于Gαs的剪接变体)；GTP-水解和所导致的Gαs灭活需要完好的鸟嘌呤残基(4)。在用霍乱毒素预处理造血干细胞后的确可以观察到增强的移入：如果干细胞制剂已经用霍乱毒素预处理(1)，在骨髓中存在大约两倍多的(Lin-)前体细胞。然而，对于用于进行骨髓移植的患者的干细胞制剂，霍乱毒素将是高度不利的。霍乱毒素(CT)，尤其是其非毒性B亚基五聚体结构部分(CTB)是在体内和体外均具有强免疫调节特性的黏膜佐剂，并且是最有效的黏膜免疫原之一。霍乱毒素和CTB刺激强的肠IgA抗体应答和长期持续的免疫记忆。基于此，CTB已经成为最近开发的针对由肠毒性大肠杆菌(E.coli)引起的霍乱和腹泻的口服疫苗的重要成分。CT和CTB的强免疫原性在很大程度上可以由其结合在肠黏膜表面上的受体的能力所解释。另外，在感染的天然过程中，毒素分子的五聚体部分B结合肠上皮细胞的表面，并且与A亚基一起被迅速内吞。一旦被内吞，催化活性的A-亚基脱离五聚体部分B并且通过由B-亚基形成的孔进入细胞。一旦在细胞内，其永久性地使异三聚体G蛋白的Gsα亚基核糖基化，导致组成型cAMP的产生。这又导致H2O，Na+，K+，Cl-和HCO3-分泌到小肠的腔内，导致快速脱水以及与霍乱相关的其他因子。如果静脉内注射，则霍乱毒素被大部分细胞摄取(仅诸如血脑屏障的细胞被特定的屏障屏蔽)。因此，其在大部分体细胞中增加cAMP，引起大范围的副作用(从心动过速到血管舒张、肌肉震颤、高血糖等)。因此，这些作用使得霍乱毒素不能用于人用来刺激造血干细胞。然而，在进行异源骨髓移植(即，由免疫相容性供体收集的造血干细胞)时，刺激干细胞的治疗相关性是重要的，并且是用于治疗患有白血病的人、治疗患有血细胞区室遗传缺陷(例如，血红蛋白病(haemoglobinopathies)如地中海贫血症(thalassaemia)；中性粒细胞功能缺陷等)的人的标准方法。由于自体骨髓移植是用于增加细胞毒性药物的治疗窗(therapeuticwindow)并且因此允许高剂量强度的化疗的标准方法(5，6)，其也是重要的。造血干细胞表达所有四种前列腺素E受体(EP1-4)。用(二甲基化的)前列腺素E2预处理造血干细胞增强其移入(7，8)。这种作用由经典的Gαs-依赖性信号传导介导，原因在于cAMP-诱导的蛋白激酶A(PKA)活化协同Wnt-依赖性信号来稳定β-连环蛋白(9)。按照Otsuka等人，在兔模型中，通过贝前列素钠(Beraprostsodium)可以增强自体骨髓(BM)单核细胞(MNCs)的移入。研究的目的是支持外周和心肌缺血中的动脉发育。然而，造血干细胞是骨髓细胞中的特定类型的细胞(16)。Madonna等人描述了干细胞疗法和药理学治疗的组合，其中在冠状动脉内施用后在ADSC心肌移入中检测前列环素(17)。IshiiM.等人公开了前列环素的持续不变的释放增强间质干细胞的促血管生成功能和缺血组织中的肌肉细胞生长(18)。WO2006/017169描述了用于控制组织生长的具有生物相容性涂层的可植入传感器，其可以特别包含前列环素类似物。CrutchleyD.等人描述了西卡前列素(Cicaprost)或伊洛前列素(Iloprost)对人THP1细胞中的组织因子、肿瘤坏死因子和白介素-1β合成的抑制作用(19)。干细胞在移入后的定位是移植成功的关键决定因素。目前，由于干细胞不能成功地移入到骨髓中，并且存在长期的骨髓发育不全而导致成熟的血细胞的减少，因此对于移植需要大量的干细胞。因此，提供刺激HSCs以增加分离的HSCs向进行骨髓移植的受试者的骨髓生态位的归巢、移入和保持的方法和组合物仍然是未满足的需求。所述问题通过本专利技术的实施方案得以解决。专利技术简述：已经令人惊讶地表明合成的前列环素I2(PGI2)类似物如例如曲前列尼、伊洛前列素、贝前列素和西卡前列素能够增加造血干细胞中的cAMP水平，这导致在骨髓中增加的干细胞移入。与前列环素E2相比，前列环素类似物如曲前列尼提供数种优点：(i)其是前列环素/PGI2的稳定的类似物，其还刺激EP2-和EP4-受体(10)。因此，其具有刺激多种Gs-偶联的受体而不结合抑制性(即Gi-偶联的)EP3-受体的潜能，所述抑制性EP3-受体抑制cAMP累积。对于后者，二甲基-PGE2是完全的激动剂(1)。相比之下，曲前列尼仅是针对EP3-受体的低亲和性激动剂。(ii)由于其在代谢上比天然前列环素更稳定，如果在体内应用时，曲前列尼、伊洛前列素、贝前列素和西卡前列素可以激发持续更长久的作用，并且因此支持更有效的骨髓移入。(iii)延长的/重复的施用前列环素类似物，特别是曲前列尼、伊洛前列素、贝前列素和西卡前列素是充分耐受的。本专利技术提供一种通过离体预处理增强造血干细胞的移入的新方法，所述方法包括下述步骤：a.获得包含造血干细胞的样品，并且b.与至少一种前列环素类似物混合以得到混合物，c.将所述混合物温育一段时间，所述时间足以在所述细胞中刺激Gαs-信号传导，和任选地d.分离和任选地纯化所述被刺激过的细胞。按照本专利技术的一个实施方案，所述所述前列环素类似物选自下列各项的组：曲前列尼，伊洛前列素，西卡前列素和贝前列素或其药用盐。按照本专利技术的方法，还可以提供被刺激过的和未被刺激过的干细胞的混合物。特别地，所述样品是骨髓。所述干细胞通常是任意已知的来源的，特别地，其可以为由外周血、脐带血或骨髓分离的HSCs。按照本专利技术，曲前列尼可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.01.13 EP 1115083541.至少一种前列环素类似物以及非特异性cAMP活化剂在制备用于通过离体预处理造血干细胞(HSCs)增强造血干细胞移入的试剂中的应用，其中所述至少一种前列环素类似物以及非特异性cAMP活化剂用于混合包含造血干细胞的样品以得到混合物，其中所述混合物被温育足以在所述细胞中刺激Gαs-信号传导的一段时间，和任选地所述被刺激的细胞被分离，其中所述前列环素类似物选自下组：曲前列尼，伊洛前列素，西卡前列素和贝前列素或其药用盐，其中所述非特异性cAMP活化剂选自弗司扣林和霍乱毒素的组。2.根据权利要求1所述的应用，其中所述前列环素类似物是曲前列尼。3.根据权利要求2所述的应用，其中所述曲前列尼是选自下组的曲前列尼衍生物：曲前列尼的酸衍生物，曲前列尼的前药或曲前列尼的多晶型体。4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其中所述样品是骨髓。5.一种包含至少一种前列环素类似物以及非特异性cAMP活化剂的组合物，所述组合物用于治疗患有骨髓疾病的个体，其中所述前列环素类似物选自下组：曲前列尼，伊洛前列素，西卡前列素和贝前列素或其药用盐，其中所述非特异性cAMP活化剂选自弗司扣林和霍乱毒素的组。6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述前列环素类似物是曲前列尼。7.根据权利要求6的组合物，其中所述曲前列尼是选自下组的曲前列尼衍...

【专利技术属性】
技术研发人员：米夏埃多·弗赖斯穆特，埃娃玛丽亚·泽贝迪恩布兰德尔，克里斯蒂安·贝格迈尔，菲尔扎·侯赛因，
申请(专利权)人：塞法姆公司，
类型：
国别省市：