一种利用亚健康者自体的血源性细胞分离纯化并培养出能够用于亚健康治疗的干细胞，涉及基础医学、健康保健医学领域。从亚健康者体内取出血源性细胞分离纯化干细胞，并在特定的培养体系中进行扩增培养，在干细胞总数达到一定数目后，通过静脉输注，治疗亚健康者。造血干细胞能够重建机体的免疫系统功能，能用于亚健康者自身的康复。本培养扩增体系可以迅速扩增干细胞并保持干细胞特性，移植时无需配型，用于亚健康者的保健或治疗，无毒副作用和不良反应，并具有良好效果。同时，不像其它亚健康治疗法如中医疗法、自然疗法、运动、营养疗法等，自体造血干细胞移植后可以替代衰老的机体细胞，为亚健康人群治疗提供了良好的康复途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是利用自体血细胞培养扩增出能用于亚健康治疗的干细胞，涉及基础医学、健康科学领域。
技术介绍
“亚健康”指的是介于健康和疾病之间的一种生理功能低下的状态，主要表现为出现明显身心不适现象但机体无结构和代谢的异常。亚健康状态是没有明显临床症状的，也不能用相关临床诊断指标确诊。常见"亚健康"状态表现:浑身无力，容易疲倦，思想涣散，头痛，耳鸣，眼睛疲劳，鼻塞眩晕，咽喉异物感，手足发凉麻木，便秘，颈肩僵硬，胃闷不适，睡眠不良，心悸气短，容易晕车，起立时眼前发黑，早晨起床有不快感等。目前，亚健康已经被医学界公认为是与艾滋病并列的21世纪人类健康的大敌，世界卫生组织最近公布的一项预测性调查表明，全世界由于心理、体能应激等因素造成的亚健康人群总比例已占到75% ;在我国，亚健康状态人群约占我国人口的70%。关于亚健康病因学说，当前比较流行的是免疫学说和自由基学说。亚健康的治疗目前常用的方法有中医疗法、自然疗法、运动疗法、营养疗法等，这些疗法具有一定的效果，但不能很好地改善亚健康人群身体状况。干细胞(Stem Cell, SC)是一类具有自我复制、高度增值和多向分化潜能的细胞群体。它们可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而构成机体各种复杂的组织器官。按照发育时间，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞，按照干细胞的分化潜能又可分为造血和非造血干细胞，非造血干细胞包括脂肪干细胞、神经干细胞、皮肤干、肝脏干、心脏干、生殖干、肌肉干等；造血干细胞包括骨髓干、外周干、脐带血干细胞、胎肝血干细胞。自20世纪70年代以来，骨髓移植和外周血干细胞移植在血液病、实体瘤、遗传性疾病方面取得了良好的临床疗效。1988年，法国人Gluckman成功地对一名5岁范可尼贫血患儿进行了世界上首例脐带血造血干细胞移植，此后，法、美、澳等相继成功完成了几例此类干细胞移植。美国纽约血液中心于1993分别完成HLA相合的非血缘的和HLA不相合的同胞间的脐带血造血干细胞移植，均获得成功。干细胞不仅在血液系统疾病的治疗显现神威，在神经系统疾病、骨关节疾病、心血管疾病、代谢性疾病如糖尿病、自身免疫性疾病，以及在亚健康治疗、抗衰老、美容等方面都有很好的应用。国内外研究表明，外周血含有较为丰富的造血干细胞，这些干细胞的增殖能力较强，并能够分化为造血细胞、免疫细胞等并能生成相关因子。在白血病移植治疗中，外周血可以促进免疫功能的重建，同时采用自体血干细胞不仅可以免去移植配型，还可以免去病毒的检测。因此，自体血干细胞为亚健康人群的康复治疗提供了新途径。 然而不论是对于疾病的治疗，还是亚健康的康复，如何获得充足的造血干细胞是长期以来医疗界面临的难题。早期扩增造血干细胞多采用联合应用造血生长因子如SCF、FL、TPO、GM-CSF, G-CSF, IL_3、IL_6、Lif、bFGF等不同组合方式体外扩增造血干细胞，但均存在细胞扩增倍数不充足、扩增后细胞可能已经具有定向分化能力等问题，因此其临床应用受到局限。本专利技术采用间充质干细胞作为铺垫细胞，同时配以营养因子培养扩增造血干细胞，为亚健康者移植治疗提供了良好的技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种亚健康治疗用造血干细胞技术，它是获取亚健康人群外周血，并在100级GMP厂房中以脐带间充质干细胞为铺垫细胞，添加相关营养因子培养扩增造血干细胞。经质检合格后再回输给亚健康者本人，达到其康复的作用。此种干细胞移植无需配型，无需检测特定的病毒，简单易行、安全可靠，为亚健康者的康复治疗提供了良好的方法。具体实施例方式通过本实施例来具体说明本专利技术亚健康治疗用自体造血干细胞技术，这里用自体外周血干细胞为例说明具体步序如下:(I)基质细胞培养，签订产妇脐带捐献同意书，在产房无菌条件下取得产妇脐带，36小时内在GMP车间的100级层流罩内将脐带组织的血管去除，剪成lmm3大小的组织块，接种于T75细胞培养瓶，DMEM完全培养液并添加营养因子，S卩10ng/ml ITS (胰岛素、转铁蛋白、硒)，100u/ml 青霉素，100u/ml 链霉素,20ng/ml of rEGF), 20ng/ml of rPDGF-bb),lOng/ml of LIF，20ng/ml of bFGF，放置于 37°C、5% C02 的培养箱中培养。7-10 天后，间充质干细胞从组织块边缘长出，换液，并补充营养因子。细胞汇合度达80 %时，干细胞用0.25%的胰酶消化并过滤，细胞悬液用800r/min离心6min，以DMEM完全培养液重悬，并传代于T 175ml培养瓶(Pl代)，补充营养因子，之后的传代按照1: 3比例传。(2)自体造血干细胞培养，无菌状态下抽取亚健康者外周静脉血10毫升，用肝素(20U/mL)抗凝，在100级GMP厂房中，应用干细胞分离机采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血中干细胞(CD34+ 细胞)。取肝素抗凝静脉血与等量Hank ‘s液或DMEM完全培养基充分混匀，加入1.077g/mL Ficoll淋巴细胞分离液3mL，注意保持清楚的界面，水平离心2000rpmX20分钟。离心后管内分为三层,上层为血衆和Hank ‘s液,下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，此外，还含有血小板。用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一短管中，加入5倍以上体积的Hank ‘s液或DMEM完全培养基，1500rpmX 10分钟，洗涤细胞三次，并重悬于DMEM完全培养基。单核细胞以I X IO5Cells/mL密度种植于T175培养瓶(其中已含有P2代已处于60%细胞汇合度的基质脐带间充质干细胞)，补充营养因子:50ng/mL of SCFU0U/M1 of TP0、50ng/mL of G_CSF、2.7% 甲基纤维素、100ng/mLGM-CSF、lX500UI/ml of IL_l、10ng/ml of IL_3、10ng/ml of Flt3_L，每三天换液一次。(3)造血干细胞的传代培养，先将间充质干细胞培养上清液取出，800r/min离心6min，离心上清液再过滤以出去杂质，少许滤液重悬干细胞沉淀。将另一处于60%细胞汇合度的P 2代脐带间充质干细胞培养(T 175ml培养瓶)上清液过滤，三分之一加入原培养瓶，原造血干细胞培养液三分之一用于重悬的造血干细胞，另补充三分之一新鲜培养液并补充营养因子(间充干和造血干培养营养因子)，放置于37°C、5% C02培养箱饱和湿度培养，每3d换一次。(4)自体造血干细胞移植，将扩增的造血干细胞进行质检:干细胞离心上清液做细菌涂片染色、微生物培养(厌氧菌、需氧菌培养、真菌和霉菌)、有核细胞计数、干细胞活力计数、CD34+细胞计数、干细胞集落形成实验。干细胞移植前签订知情者同意书，自体外周血干细胞经质检合格后，以3X105/KG的干细胞剂量回输给亚健康者。剩余的干细胞冻存(将制备好的自体干细胞 加入10% DMSO和1% BSA，存入-196°液氮罐保存)。权利要求1.亚健康治疗用自体造血干细胞技术，其特征是，它按如下步序进行: (1)基质细胞培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
亚健康治疗用自体造血干细胞技术，其特征是，它按如下步序进行：(1)基质细胞培养，无菌条件下取得产妇脐带，在GMP车间处理脐带并培养脐带间充质干细胞。(2)自体造血干细胞培养，在无菌条件下取得外周静脉血，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血干细胞，并接种于以脐带间充质干细胞为基质的培养体系。(3)造血干细胞的传代培养，先将间充质干细胞培养上清液取出，离心，贴壁细胞接种于另一脐带间充质干细胞培养。(4)自体造血干细胞移植，将扩增的造血干细胞通过静脉移植亚健康者本人。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙勇，
申请(专利权)人：孙勇，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。