一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒。本发明专利技术提供的试剂盒，包括组件A、B、C、D、E、F、G和H；组件A为用于制备骨髓单个核细胞的物质；组件B为用于培养骨髓间充质干细胞形成集落的物质；组件C为用于对骨髓间充质干细胞集落进行计数的物质；组件D为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成骨细胞的能力的物质；组件E为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成脂肪细胞的能力的物质；组件F为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有抑制T淋巴细胞增殖的能力的物质；组件G为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有作为造血干细胞的饲养细胞的能力的物质。本发明专利技术提供的试剂盒操作简单、方便实用，可以检测造血干细胞移植术后骨髓造血微环境恢复情况，为间充质干细胞的研究应用奠定了基础。

Kit for identifying effect of hematopoietic stem cell transplantation

The invention discloses a kit for identifying the effect of hematopoietic stem cell transplantation. The kit, including A, B, C, components D, E, F, G and H; A components for the preparation of bone marrow mononuclear cell substance; component B for cultured bone marrow mesenchymal stem cells colony forming material; C component for drop counting material the bone marrow mesenchymal stem cells; D components for identification of bone marrow mesenchymal stem cells have differentiated into osteobalsts substance; component E for identification of bone marrow mesenchymal stem cells have differentiated into adipose cells of the material; F components for identification of bone marrow mesenchymal stem cells have the ability to inhibit the proliferation of T lymphocytes of the substance; component G for identification of bone marrow mesenchymal stem cells of hematopoietic stem cells as feeder cells of material. The kit provided by the invention has the advantages of simple operation, convenience and practicability, and can detect the recovery of the hematopoietic microenvironment after the hematopoietic stem cell transplantation, so as to lay a foundation for the research and application of the mesenchymal stem cells.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒
本专利技术涉及一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒。
技术介绍
造血干细胞移植是治疗多种恶性血液病的最有效的手段之一。在移植入健康的造血干细胞之前，通常需要借助各种药物或者放射线对患者体内的恶性血液病细胞进行清除(医学上常称之为预处理)，这种大剂量的药物或者放射线往往在杀灭了肿瘤细胞的同时也破坏了患者骨髓内的造血微环境。骨髓造血微环境位于骨髓腔内，主要指骨髓内的基质细胞(包括成骨细胞、成脂肪细胞、间充质干细胞和内皮细胞等)，它们通过分泌各种细胞因子(IFN-Y、IL-1 β、IL-17、IL-6 > IL-7 > VEGF> SCF> TGF- β )和表达表面黏附分子(Angiopoientin-Ι、β _catenin、CD44、CXCLl2, Jaggedl、Noctch-1、N-cadherin、VLA-4、VLA-5、Tie-2)来支持造血干细胞的自我更新和多向分化。当患者接受了造血干细胞移植术后，输入的健康的造血干细胞首先归巢到骨髓造血微环境中并且植入，进行增殖，再迁移到脾脏和胸腺等免疫器官内进行造血系统和免疫系统的重建。如果造血干细胞移植术后造血和免疫重建严重迟缓,细胞免疫持续功能低下，将会引起严重感染和白血病复发，甚至导致患者死亡。因此，检测造血干细胞移植术后患者骨髓造血微环境的重建对于评价患者造血系统和免疫系统能否恢复以及恢复的快慢至关重要，可以为优化治疗方案提供有力的科学依据。然而，目前对于骨髓造血微环境的重建还缺乏科学有效的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是 提供一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒。本专利技术提供了一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒，包括组件A、组件B、组件C、组件D、组件E、组件F、组件G和组件H ;所述组件A为用于制备骨髓单个核细胞的物质；所述组件B为用于培养骨髓间充质干细胞形成集落的物质；所述组件C为用于对骨髓间充质干细胞集落进行计数的物质；所述组件D为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成骨细胞的能力的物质；所述组件E为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成脂肪细胞的能力的物质；所述组件F为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有抑制T淋巴细胞增殖的能力的物质；所述组件G为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有作为造血干细胞的饲养细胞的能力的物质；所述组件H为记载有如下判断标准的载体:如果满足如下(I)至(5)，造血干细胞移植术后骨髓微环境重建成功:(I)患者进行造血干细胞移植术后9个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞数量与该患者进行造血干细胞移植术的预处理前的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞数量没有显著差异；(2)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有分化成成骨细胞的能力；(3)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有分化成成脂肪细胞的能力；(4)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有抑制T淋巴细胞增殖的能力；(5)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有作为造血干细胞的饲养细胞的能力。所述(4)中，所述“抑制T淋巴细胞增殖”指的是“PHA或同种异体T淋巴细胞刺激引起的T淋巴细胞增殖”。所述(4)和/或(5)中，所述骨髓间充质干细胞具体可为转至第0-6代的骨髓间充质干细胞，具体可为转至第4代的骨髓间充质干细胞。所述组件A为人淋巴细胞分离液或所述组件A包括人淋巴细胞分离液。用所述组件A制备骨髓单个核细胞的方法具体如下:( I)用PBS缓冲液吹打悬浮骨髓样本，得到细胞悬液；(2)取试管，加入4毫升人淋巴细胞分离液和4毫升步骤(1)得到的细胞悬液，保持界面完整，1500rpm离心15分钟，取骨髓单个核细胞层(即自上而下的第二层)。所述组件B为含5-20% (具体可为10% )体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基或所述组件B包括含10%体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基。用所述组件B培养骨髓间充质干细胞形成集落的方法具体如下:取6孔培养板，按照2X IO5个细胞/平方厘米的密度接种骨髓单个核细胞，采用含5-20% (具体可为10%)体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基，在35-38°C、5-15%C02条件下(具体在37°C、5%C02条件下)培养14天，每隔两天全量更换相同的培养基。所述组件C为结晶紫或所述组件C包括结晶紫。所述组件D包括成骨分化诱导液和碱性磷酸酶染色试剂。所述成骨分化诱导液具体如下:含50 μΜ抗坏血酸磷酸盐、0.1 μΜ地塞米松、IOmM β -磷酸甘油和5-20% (具体可为10% )体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基。用所述组件D诱导骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞的方法具体如下:取骨髓间充质干细胞，加入成骨分化诱导液，在37°C、5%C02条件下培养14天(每隔两天全量更换相同的成骨分化诱导液)，然后利用碱性磷酸酶染色试剂盒鉴定成骨细胞。所述组件D具体可由成骨分化诱导液和碱性磷酸酶组成。所述组件E包括成脂肪分化诱导液和油红O。所述成脂肪分化诱导液的具体如下:含I μ M地塞米松、10 μ g/ml胰岛素和5_20%(具体可为10% )体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基。用所述组件E诱导骨髓间充质干细胞分化成成脂肪细胞的方法具体如下；取骨髓间充质干细胞，加入成脂肪分化诱导液，在37°C、5%C02条件下培养14天(每隔两天全量更换相同的成脂肪分化诱导液)，然后利用油红染色鉴定脂肪细胞。所述组件E具体可由成脂肪分化诱导液和油红组成。所述组件F包括离体的人⑶3+T淋巴细胞和CFSE。用所述组件F鉴定骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的抑制能力的一种具体方法如下:(I)取ImL人⑶3+T淋巴细胞的细胞悬液，加入CFSE并使其浓度为10 μ Μ，室温孵育25分钟，然后加入IOmL含2% (体积比)胎牛血清的PBS缓冲液以终止反应，1000rpm离心10分钟，收集细胞；(2)取6孔板，按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种骨髓间充质干细胞，然后接种步骤(1)得到的人CD3+T淋巴细胞(使骨髓间充质干细胞与人CD3+T淋巴细胞的数量比为1:10)，加入PHA并使其浓度为2 μ g/ml，在37°C、5%C02条件下培养2_4天，收集人CD3+T淋巴细胞并采用流式细胞仪检测。[0031 ] 用所述组件F鉴定骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的抑制能力的另一种具体方法如下:(I)取ImL人⑶3+T淋巴细胞的细胞悬液，加入CFSE并使其浓度为10 μ Μ，室温孵育25分钟，然后加入IOmL含2% (体积比)胎牛血清的PBS缓冲液以终止反应，1000rpm离心10分钟，收集细胞；(2)取6孔板，按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种骨髓间充质干细胞，然后接种步骤(1)得到的人CD3+T淋巴细胞(使骨髓间充质干细胞与人CD3+T淋巴细胞的数量比为1:10)，然后按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种用IOGy剂量的钴-60照射过的同种异体的人⑶3+Τ淋巴细胞，在37°C、5%C02条件下培养2-4天，收集人⑶3+T淋巴细胞并采用流式细胞仪检测。所述组件F包括同种异体的人⑶3+本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒，包括组件A、组件B、组件C、组件D、组件E、组件F、组件G和组件H；所述组件A为用于制备骨髓单个核细胞的物质；所述组件B为用于培养骨髓间充质干细胞形成集落的物质；所述组件C为用于对骨髓间充质干细胞集落进行计数的物质；所述组件D为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成骨细胞的能力的物质；所述组件E为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成脂肪细胞的能力的物质；所述组件F为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有抑制T淋巴细胞增殖的能力的物质；所述组件G为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有作为造血干细胞的饲养细胞的能力的物质；所述组件H为记载有如下判断标准的载体：如果满足如下（1）至（5），造血干细胞移植术后骨髓微环境重建成功：（1）患者进行造血干细胞移植术后9个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞数量与该患者进行造血干细胞移植术的预处理前的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞数量没有显著差异；（2）患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有分化成成骨细胞的能力；（3）患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有分化成成脂肪细胞的能力；（4）患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有抑制T淋巴细胞增殖的能力；（5）患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有作为造血干细胞的饲养细胞的能力。...

【技术特征摘要】
1.一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒，包括组件A、组件B、组件C、组件D、组件E、组件F、组件G和组件H ;所述组件A为用于制备骨髓单个核细胞的物质；所述组件B为用于培养骨髓间充质干细胞形成集落的物质；所述组件C为用于对骨髓间充质干细胞集落进行计数的物质；所述组件D为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成骨细胞的能力的物质；所述组件E为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成脂肪细胞的能力的物质；所述组件F为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有抑制T淋巴细胞增殖的能力的物质；所述组件G为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有作为造血干细胞的饲养细胞的能力的物质； 所述组件H为记载有如下判断标准的载体:如果满足如下(I)至(5)，造血干细胞移植术后骨髓微环境重建成功: (O患者进行造血干细胞移植术后9个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞数量与该患者进行造血干细胞移植术的预处理前的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞数量没有显著差异; (2)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有分化成成骨细胞的能力； (3)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有分化成成脂肪细胞的能力； (4)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有抑制T淋巴细...

【专利技术属性】
技术研发人员：王恒湘，丁丽，郭子宽，朱恒，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军总医院，
类型：发明
国别省市：