本发明专利技术提供了RPL13A作为内参基因在RT‑qPCR检测进入高原前后血液中基因表达中的应用，属于RT‑qPCR检测技术领域。本发明专利技术提供了RPL13A作为内参基因在RT‑PCR检测进入高原前后血液中基因表达中的应用；所述基因为低氧相关通路相关的基因。通过实时荧光定量PCR方法扩增RPL13A，得到扩增效率和Ct值，根据Ct值计算得到稳定度的平均值M，分析稳定度的平均值M和扩增效率发现，RPL13A在进入高原前后血液中稳定表达，说明以RPL13A作为参照基因定量检测进入高原前后人血液中不同目的基因的转录表达水平，能有效提高定量检测目的基因的精确度。
Application of RPL13A as internal reference gene in RT-qPCR gene expression before and after Entering Plateau
The invention provides the application of RPL13A as an internal reference gene in the detection of gene expression in blood before and after Entering Plateau by RT_q PCR, and belongs to the technical field of RT_q PCR detection. The present invention provides the application of RPL13A as an internal reference gene in the detection of gene expression in blood before and after Entering Plateau by RT_PCR; the gene is a gene related to hypoxia-related pathway. RPL13A was amplified by real-time fluorescence quantitative PCR and the amplification efficiency and CT value were obtained. The average stability M was calculated according to CT value. By analyzing the average stability M and amplification efficiency, it was found that RPL13A was stably expressed in the blood before and after entering the plateau, indicating that RPL13A was used as a reference gene for quantitative detection of human blood before and after entering the plateau. The transcription and expression levels of different target genes in the solution can effectively improve the accuracy of quantitative detection of target genes.
【技术实现步骤摘要】
RPL13A作为内参基因在RT-qPCR检测进入高原前后血液中基因表达中的应用
本专利技术属于RT-qPCR检测
，具体涉及RPL13A作为内参基因在RT-qPCR检测进入高原前后基因表达中的应用。
技术介绍
低压低氧是高原环境的特征之一。在低氧条件下，机体可通过低氧相关通路诱导多种基因的表达，包括EPAS1和EGLN1。越来越多的研究表明缺氧诱导因子通路在低氧适应中起到重要作用，其中编码缺氧诱导因子HIF-2α的EPAS1可通过进一步调控多种基因的表达而使机体适应高原低氧环境。为了检测高原低氧适应过程中的分子机制，不可避免地要对其所涉及的基因表达进行定量检测。实时定量PCR(quantitativereal-timePCR，RT-qPCR)就是一种在转录水平对mRNA进行定量的方法，具有快速、重复性好和高灵敏等优点。因此，RT-qPCR在基因表达的定量研究中获得广泛应用。然而，为了获得RT-qPCR分析检测的最佳结果，依据实时荧光定量PCR国际化标准(MIQE)要求，提出了RT-qPCR实验的最少需求，其中包括合适的内参基因。为了降低实验中的差异，通常在研究中会选择管家基因作为内参基因对目的基因进行校正和标准化，以校正转录效率和cDNA用量，弥补制备过程中样本纯度和浓度的差别，从而避免mRNA转录效率、样品操作及下游处理步骤造成的误差。在分析中选用一种合适的稳定表达的内参基因对目的基因的表达量进行校正可以提高该方法的灵敏度和重复性。然而研究表明，机体在不同的环境条件下，多种可作为内参基因的管家基因表达也会随所处环境或处理条件不同而不稳定，造成不能准确检测目的基因表达。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供RPL13A作为内参基因在RT-PCR检测进入高原前后血液中基因表达中的应用，能够准备检测目的基因表达。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了RPL13A作为内参基因在RT-PCR检测进入高原前后血液中基因表达中的应用；所述基因为低氧相关通路相关的基因。优选的，所述RPL13A具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。优选的，所述RPL13A的扩增引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。优选的，所述血液包括白细胞层。优选的，所述高原的海拔高度为3500～4500米。优选的，所述进入高原前所处区域的海拔高度为70～500米。优选的，进入高原后的时间为2～4d。优选的，所述低氧相关通路相关的基因包括EPAS1或EGLN1。优选的，所述RT-PCR检测的扩增程序为95℃，2min；95℃、5s，退火57℃、20s，延伸72℃，20s，共40个循环；72℃，10min。本专利技术提供了一种检测进入高原前后血液中基因表达的试剂盒，包括所述应用中的引物。本专利技术提供了RPL13A作为内参基因在RT-PCR检测进入高原前后血液中基因表达中的应用。通过实时荧光定量PCR方法扩增RPL13A，得到扩增效率和Ct值，根据Ct值计算得到稳定度的平均值M，分析稳定度的平均值M和扩增效率发现，RPL13A在进入高原前后血液中稳定表达，说明以RPL13A作为参照基因定量检测进入高原前后人血液中不同目的基因的转录表达水平，能有效提高定量检测目的基因的精确度。进一步的，本专利技术提供的应用，进一步限定了检测基因的种类为EPAS1，与平原时期相比，进入高原后EPAS1表达上调了5倍。RPL13A基因在进入高原前后表达稳定，而且能够反应功能基因在不同海拔环境下人血液中基因的变化，可作为定量进入高原前后血液中目的基因检测的内参基因。附图说明图1为实施例1中8个候选基因的溶解曲线；图2为实施例1中8个候选基因的稳定性平均值M变化趋势；图3为实施例2中EPAS1基因在进入高原前后表达量柱形图；图4为实施例3中EGLN1基因在进入高原前后表达量柱形图。具体实施方式本专利技术提供了RPL13A作为内参基因在RT-PCR检测进入高原前后血液中基因表达中的应用；所述基因为低氧相关通路相关的基因。在本专利技术中，所述RPL13A优选具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。具体检测方案包括以下步骤：RPL13A作为内参基因检测利用RT-PCR方法检测进入高原前后血液中基因表达情况。所述RPL13A用扩增引物优选包括正向引物和反向引物；所述正向引物优选具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；所述反向引物优选具有如序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。所述RT-PCR扩增RPL13A的扩增程序为95℃，2min；95℃、5s，退火57℃、20s，延伸72℃，20s，共40个循环；72℃，10min。在本专利技术中，所述血液优选包括白细胞层。所述白细胞层的收集方法为将血液离心，收集白细胞层。所述离心的转速优选为2800～3200rpm，更优选为3000rpm。所述离心的时间优选为4～7min，更优选为5min。得到白细胞层后，本专利技术优选调整所述白细胞层的细胞浓度，将调整浓度后的体系作为待测样品。调整后细胞浓度优选为107个细胞/ml。本专利技术对调整细胞浓度的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的调整细胞浓度的方法即可。采用TRIzol法从白细胞层中提取RNA。在本专利技术中，为了对比人体进入高原前后血液中基因的表达情况，所述血液采集自进入高原前和进入高原后的人体血液。所述高原的海拔高度优选为3500～4500米，更优选为3700米。所述进入高原前的海拔高度优选为70～500米，更优选为200米。进入高原后的时间优选为2～4d，更优选为3d。在本专利技术中，所述低氧相关通路相关的基因优选包括EPAS1或EGLN1。所述EPAS1扩增引物包括正向引物和反应引物，所述正向引物具有如序列表中SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；所述反向引物优选具有如序列表中SEQIDNo.5所示的核苷酸序列。所述EGLN1扩增引物包括正向引物和反应引物，所述正向引物具有如序列表中SEQIDNo.6所示的核苷酸序列；所述反向引物优选具有如序列表中SEQIDNo.7所示的核苷酸序列。在本专利技术中，所述RT-PCR检测EPAS1或EGLN1的扩增程序优选为95℃，2min；95℃、5s，退火57℃、20s，延伸72℃，20s，共40个循环；72℃，10min。本专利技术提供了一种检测进入高原前后血液中基因表达的试剂盒，包括所述应用中的引物。所述试剂盒的使用方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的RT-PCR方法即可。下面结合实施例对本专利技术提供的RPL13A作为内参基因在RT-PCR检测进入高原前后血液中基因表达中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。实施例11、样品的准备六名健康汉族男性志愿者(21.3±1.3岁)在平原和进入高原(海拔3700米)3天后收集EDTA-2Na抗凝的静脉血10ml。这些志愿者在进入高原后无明显的高原反应表现。所有的志愿者均签署了知情同意书。血液采集后，通过离心(3000rpm)5分钟，收集白细胞层，以每107个白细胞加入1mlTRIzol，放入-80℃备用。2、样品RNA提取取出制备好的裂解样本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.RPL13A作为内参基因在RT‑PCR检测进入高原前后血液中基因表达中的应用；所述基因为低氧相关通路相关的基因。
【技术特征摘要】
1.RPL13A作为内参基因在RT-PCR检测进入高原前后血液中基因表达中的应用；所述基因为低氧相关通路相关的基因。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RPL13A具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述RPL13A的扩增引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血液包括白细胞层。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高原的海拔高...
【专利技术属性】
技术研发人员：李翠莹，李小薇，肖军，刘娟，范秀，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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