用于获得抗疏水性肽抗体的抗原的制备方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种方法以获得针对疏水性肽的抗体，该疏水性肽可以容易地用于多种用途并且可靠性高。该制备抗原的方法的特征在于，在含有非离子表面活性剂的水溶液中将未结合至载体蛋白的疏水性肽用作高分子量聚集体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于获得抗疏水性肽抗体的抗原的制备方法
本专利技术涉及一种免疫工程学领域中制备抗原的方法。特别是，本专利技术涉及一种在不使用载体蛋白下采用疏水性肽作为免疫原，为获得抗疏水性肽抗体而制备抗原的方法。
技术介绍
由于抗体具有非常特异的分子识别能力和高亲和力，并且在待分析的靶分子中被容易制造的可能性高，所以几十年来，抗体一直被用作许多实验室中非常有用的研究试剂，并且实际上被用于从诊断剂到药剂的广泛应用中。在许多情况下，抗体的靶标是蛋白质，但是抗体也被用于如某种药物和环境污染物等低分子量靶标化合物的高灵敏度检测。在人类基因组分析完成后，近来，人们正积极地研究专注于人类的哺乳动物细胞中数万计的基因产物的表达状态和功能。数万至数十万计的蛋白质在组织和细胞中混合。为了检查这些蛋白质中特定的一种的表达状态和定位，抗体是至关重要的。在分化和组织再生以及癌细胞和干细胞的研究中，作为用于细胞分选(cellsorting)(其中不同功能的细胞从相同的群体中分级)和用于理解分化控制的分化标记物的检测手段，抗体已变成不可缺少的工具。而且，抗体还经常用于特定蛋白质分子和特定疾病之间相关性的基础研究中。这些研究导致诊断剂的发展。抗体药物是由对特定蛋白质分子的中和作用和对疾病疗效的研究中发展起来的。如上所述，抗体在从基础研究到直接的实际应用的广泛应用范围中使用。为获得抗体，通常是用抗原免疫动物。抗原可以是天然的或人工的。对于天然抗原，使用纯化的靶蛋白质或者部分纯化或未纯化的含有靶蛋白质的混合物。另一方面，人工制备的抗原的主要类型分为以下两种：(i)通过在合适的宿主中表达编码靶蛋白质或其片段的基因而制造的重组蛋白质，以及(ii)靶蛋白质的一部分的氨基酸序列的合成肽。本文所用术语“肽”是指长度3至约40个氨基酸的肽。与从天然细胞或组织中纯化靶蛋白质的情况或者与利用重组基因表达的情况相比，如果将合成肽用作抗原，由于杂质更少，抗原制备所需的时间和工作量可以有利地显著减少。随着DNA测序技术的发展，目前很容易得到氨基酸序列信息，所以使用合成肽作为抗原的免疫被频繁运用。使用合成肽作为抗原的另一个优点在于可以选择蛋白质的特定区域。经常用作抗原的合成肽长度通常为10至25个氨基酸左右。为引起免疫反应，抗原必须同时结合至B细胞和II类T细胞(非专利文献1，P.72)。当用典型的免疫接种流程，即每一至两周给药一次进行免疫时，在对动物给药后，所述抗原必须在体内保留一定时间。所述抗原必须具有至少一定的分子量来满足这些需求，但是肽通常具有较小的分子量并且在给药后迅速代谢，因此并不直接用作抗原。即使获得特异性结合到肽的抗体，由于所述抗体对于含有肽序列的原蛋白并不一定具有良好的反应性，所以使用肽的免疫还是不利的(非专利文献1)。就此而言，将肽用作抗原时比将靶蛋白质本身或其片段(分子量为约5000以上)用作抗原时获得目标抗体的可能性低，因此，通常试验两种或三种不同的肽抗原序列。关于应当选择靶蛋白质的哪个氨基酸序列作为肽抗原，绝对确定的方法仍然未知。作为通用的选择标准，应当避免可能被糖基化的位置(包括Asn-X-Thr基序的区域或富含Ser或Thr的区域)，并选择亲水性程度相对高和可能显露于分子表面的部分，或者含有脯氨酸的位点或如β-转角的弯曲部分(非专利文献1，非专利文献2)。引用列表专利文献非专利文献1:"Antibodies;ALABORATORYMANUAL,EdHarlow&DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory,1988"非专利文献2:ShinobuOhmi,KunioTsujimura,MasakiInagaki,"ExperimentalProtocolforAnti-PeptideAntibodies,"Shujunsha,1994
技术实现思路
专利技术要解决的问题随着近来蛋白质X射线结构分析技术和通过NMR的溶液中蛋白质分子的结构分析技术的发展，已揭示了许多蛋白质分子结构。根据这些发现，蛋白质中含有高比例的亲水性氨基酸序列的部分(疏水性部分)几乎不溶于中性水溶液中并保持刚性分子结构。可以这么说，该部分作为刚性部分从而形成蛋白质分子立体结构的核心，并在蛋白质分子的完整性和个性(固有的立体结构)的形成中具有重要作用。蛋白质分子的疏水性部分赋予重要的分子间相互作用，如抗原-抗体反应、配体-受体结合、细胞内信号转导、脂质和低分子量疏水化合物的运输以及细胞间通讯。细胞是生命的基本单位并通过脂双层组成的膜结构与外界分离。高等生物的细胞膜结构不仅在细胞外周，而且还在细胞内，如细胞核、内质网、高尔基体和线粒体中具有大量在进化过程中发展出的复杂的膜结构，并且这些膜结构参与多种重要的细胞功能。膜结构构建了细胞的形状，并表达出参与到如分化和形态发生等高级生命活动中的独特功能。据估计细胞中所有蛋白质种类的27%是膜蛋白质，并且从被嵌入脂双层中的位置状态可以看出，膜蛋白质富含疏水性序列。关于膜蛋白质的整体结构，已知有1至12次跨膜类型(非专利文献3)。当膜穿透(penetrations)的次数越多，蛋白质中疏水性氨基酸的比例就越高。这些跨膜蛋白质与配体转移胞外信号至细胞的受体、神经递质和药物的受体以及运载体有关。而且，这些跨膜蛋白质参与如细胞间识别、分化和形态发生等的组织形成。至少60%以上的医药目前都针对膜蛋白(非专利文献4)，并且已知多次跨膜膜蛋白质在脂双层中起作用，因此包含更高比例的疏水性部分。如上所述，迫切需要关于获得膜蛋白质的有用信息的研究，这必然增加有效制造实用的抗膜蛋白质抗体的需求。例如，NEDO(新能源和工业技术开发组织(NewEnergyandIndustrialTechnologyDevelopmentOrganization))正在进行称作“开发新功能抗体技术(DevelopmentofNewFunctionalAntibodyTechnologies)”的研究(项目周期：FY2006至FY2010；FY2009预算：9亿日元；PL：TatsuhikoKodama)，(教授，高等科学技术研究中心，东京大学)，非专利文献5。非专利文献3:M.S.Almen等,BMCbiology7:50,doi:10.1186/1741-7007-7-50,该文章来自于：http://www.biomedcentral.com/1741-7007/7/50非专利文献4:P.F.Slivka等,ACSChem.Biol.,2008,3(7),pp.402-411非专利文献5：http://www.nedo.go.jp/activities/portal/gaiyou/p06009/p06009.html以下将描述其他已知方法。除膜蛋白质以外，在细胞外、细胞核内和其他亚细胞器中作用的蛋白质穿过细胞膜。至少一种信号肽和定位肽序列参与到细胞内运动的控制和这些蛋白质的新陈代谢中(O.Bakke和T.W.Nordeng,ImmunolRev.172:171-87,1999)。所述信号肽当中通常含有高疏水性部分。如上所述，认为高疏水性氨基酸序列埋于分子中，因此当选择候选序列用于抗肽抗体的生产时通常会被避开。即使合成了由疏水性氨基酸序列组成的肽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.01.07 JP 2011-0023941.一种制备抗原的方法，其中长度为3至40个氨基酸的未结合至载体蛋白的疏水性肽在含有非离子表面活性剂的水溶液中转变为高分子量聚集体，且其中所述聚集体由非共价相互结合的几个或更多肽形成，从而形成分子量等于或大于10,000的分子，其中所述疏水性肽的序列为MLPGLALLLLAAWTARA，即SEQIDNO:1，FGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPY，即SEQIDNO:2或FLFCWILMILVVLTFVVGANVEK，即SEQIDNO:3。2.根据权利要求1所述的制备抗原的方法，其中所述非离子表面活性剂为选自由吐温20、吐温80、曲拉通X-100、NonidetP-40、PEG12、PEG24、PEG60十二烷基醚和聚乙二醇胆固醇组成的组中的至少一种。3.根据权利要求1所述的制备抗原的方法，其中在含有所述非离子表面活性剂的水溶液中，所述高分子量聚集体具有分子量等于或大于10...

【专利技术属性】
技术研发人员：冈本雅次，花村雅人，福岛均，吉田彻彦，
申请(专利权)人：东亚合成株式会社，精工爱普生株式会社，
类型：
国别省市：