特异性抗人上皮细胞粘附分子（EpCAM）的单克隆抗体的制备、鉴定及应用制造技术

本发明专利技术涉及到两种抗人上皮细胞粘附分子(EpCAM)的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性针对人上皮细胞粘附分子第24至265位的氨基酸序列，本发明专利技术还涉及生产这两种单克隆抗体的杂交瘤细胞株CCTCC?NO：C201371和CCTCC?NO：C201373，本发明专利技术还涉及单克隆抗体的制备方法及应用，本发明专利技术中EpCAM-mAb-AE4和EpCAM-mAb-AE7单克隆抗体可以用于流式和免疫荧光检测白血病患者外周血和肿瘤标本中EpCAM蛋白的表达，还可以介导ADCC体外杀伤肿瘤细胞和体内肿瘤的治疗。

【技术实现步骤摘要】
特异性抗人上皮细胞粘附分子（EpCAM）的单克隆抗体的制备、鉴定及应用
本专利技术涉及到两株抗人EpCAM的单克隆抗体。具体地说，涉及到对EpCAM第24至265位氨基酸序列中的位点有特异性的单克隆抗体，本专利技术还涉及产生这两种单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及所述单克隆抗体的制备方法和应用。
技术介绍
循环肿瘤细胞的发现最早在1869年，被定义为起源于原位肿瘤病灶或肿瘤转移病灶，并能够在病人的外周血中循环而在正常人的外周血中极少存在的一类肿瘤细胞。肿瘤诱发的血管生成通常伴随着肿瘤的侵袭，其结果是增加原位肿瘤释放高侵袭性肿瘤细胞进入外周循环的可能性。而高侵袭能力的循环肿瘤细胞不仅可以在远端器官内建立新的肿瘤病灶，也能够以肿瘤自播的形式回到原位肿瘤所在的器官内建立新的肿瘤病灶。临床癌症患者死亡率高的一个重要因素就是转移后肿瘤细胞的存在，另外循环肿瘤细胞的存在也是肿瘤手术切除后复发的主要原因。目前可行的几种循环肿瘤细胞检测平台已经通过多项临床研究证实，对于循环肿瘤细胞的检测有助于对恶性肿瘤的诊断和预后评估以及对肿瘤复发和抗癌治疗效果的监测。上皮细胞粘附分子(EpCAM：epithelialcelladhesionmolecule)，又称：ESA；KSA；M4S1；MK-1；DIAR5；EGP-2；EGP40；KS1/4；MIC18；TROP1；EGP314；HNPCC8；TACSTD1等，表达于所有正常的上皮细胞，在肿瘤细胞和增殖活跃的细胞上则呈现不同程度的表达上升，是最早被鉴定出与肿瘤相关的抗原之一。研究表明EpCAM也在肿瘤干细胞表面表达，它是wnt通路的信号受体和激活蛋白，而wnt通路调节着癌基因(比如c-myc)的表达。因此，EpCAM分子的表达从基础上关系到肿瘤的发生和发展。由于EpCAM分子表达于多种肿瘤细胞的表面，将抗EpCAM的抗体用于循环肿瘤细胞的诊断和治疗会获得更广泛的应用。同时通过鉴定该抗体的功能，探讨以EpCAM分子作为靶标的生物治疗也具有重要的临床意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种对人上皮细胞粘附分子(EpCAM)分子有特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性针对人EpCAM第24至265位的氨基酸序列。本专利技术的又一个目的是提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株EpCAM-mAb-AE4和EpCAM-mAb-AE7。由这两株杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体在本文中分别简称为AE4单克隆抗体和AE7单克隆抗体。本专利技术的又一个目的是提供本专利技术的单克隆抗体的制备方法。本专利技术的又一个目的是提供AE4和AE7的单克隆抗体在流式细胞术检测白血病患者外周血内EpCAM表达实验中的应用。本专利技术的又一个目的是提供AE4和AE7的单克隆抗体在细胞免疫荧光检测肿瘤细胞的EpCAM表达实验中的应用。本专利技术的又一个目的是提供AE4和AE7的单克隆抗体在体外能够通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞并且能够抑制体内肿瘤的生长。有益效果：本专利技术提供了两株抗人EpCAM的单克隆抗体、其制备方法、鉴定及应用，其特异性好，灵敏度高。能够应用于检测人外周血和肿瘤组织中EpCAM的表达，作为癌症转移诊断和预后评估指标之一。另外，本专利技术的单克隆抗体可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞以及抑制体内肿瘤的生长，因此，此专利技术对癌症的诊断及治疗具有重大的临床意义。具体说来，本专利技术的一个方面涉及两种EpCAM特异性的单克隆抗体及其制备方法，这两种单克隆抗体在本专利技术中分别称为AE4和AE7，它们的类型分别为IgG2b，κ和IgG2a，κ，它们均针对EpCAM第24-265位氨基酸序列。本专利技术的另外一个方面涉及稳定分泌EpCAM单克隆抗体的杂交瘤细胞株EpCAM-mAb-AE4和EpCAM-mAb-AE7。这两株杂交瘤细胞株已经于2013年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号分别为CCTCCNO：C201371和CCTCCNO：C201373。本专利技术的另外一个方面涉及制备所述单克隆抗体的方法。制备方法包括重组蛋白EpCAM的表达与纯化，用纯化后蛋白免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合，筛选出能够稳定分泌对重组EpCAM有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞培养上清中或者从小鼠腹水中获取单克隆抗体。本专利技术的另一方面涉及AE4和AE7单克隆抗体在流式检测肿瘤细胞系和癌症患者血液标本中的EpCAM表达的应用。用本专利技术的AE4或AE7单克隆抗体通过流式技术检测肿瘤细胞系和癌症患者外周血中的EpCAM蛋白的表达，结果显示：AE4和AE7单克隆抗体能在流式水平用于检测肿瘤细胞和癌症患者外周血中的EpCAM表达。本专利技术的另一方面涉及AE4和AE7单克隆抗体在免疫荧光检测肿瘤细胞及肿瘤组织内EpCAM表达中的应用。用本专利技术的AE4或AE7单克隆抗体通过免疫荧光实验鉴定肿瘤细胞系和肿瘤组织上EpCAM蛋白的表达，结果显示：AE4和AE7单克隆抗体能在免疫荧光水平用于检测肿瘤细胞系和肿瘤组织中的EpCAM表达。本专利技术的另一方面涉及AE4和AE7单克隆抗体在体外通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞，将本专利技术的AE4或AE7单克隆抗体与小鼠脾细胞(或NK细胞)和51Cr标记的NCI-H292(或K562)细胞共孵育，通过检测上清中的51Cr的释放量计算杀伤效率，结果显示这两株抗体都具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。本专利技术的另一方面涉及AE4和AE7单克隆抗体能够体内抑制移植性肿瘤(移植性肿瘤：人肺癌细胞系NCI-H292细胞接种于裸鼠皮下)的生长，肿瘤大小测量结果显示：AE4和AE7单克隆抗体能够减缓肿瘤的生长。可以使用本专利技术的AE4或AE7单克隆抗体检测或抑制的癌症选自白血病、肺癌等。因此，本专利技术提供下列各项：1.一种特异性抗人上皮细胞粘附分子(EpCAM)的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性针对人上皮细胞粘附分子第24至265位的氨基酸序列。2.根据第1项所述的单克隆抗体，其亚型为IgG2a，κ或IgG2b，κ。3.分泌第1项所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCCNO：C201371或CCTCCNO：C201373。4.第1项所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体在制备用于检测癌症的存在和/或转移的检测剂或试剂盒中的应用。5.根据第4项所述的应用，其中通过第1项所述的单克隆抗体检测人外周血和肿瘤组织中上皮细胞粘附分子的表达来判断癌症的存在和/或转移。6.根据第4项所述的应用，其中所述癌症选自白血病或肺癌。7.第1项所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体在制备用于抑制体内肿瘤生长和/或转移的药物中的应用。8.根据第7项所述的应用，其中所述癌症选自白血病或肺癌。9.一种用于检测癌症存在和/或转移的检测剂或试剂盒，所述检测剂或试剂盒包含有效量的第1项所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体。10.根据第9项所述的检测剂或试剂盒，其中所述癌症选自白血病或肺癌。11.一种用于抑制肿瘤细胞增殖和/或抑制肿瘤生长和/或转移的药物，所述药物包含治疗有效量的第1项所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体。1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性针对人上皮细胞粘附分子第24至265位的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性针对人上皮细胞粘附分子第24至265位的氨基酸序列，所述抗体的亚型为IgG2a，κ或IgG2b，κ，由保藏编号为CCTCCNO：C201371或CCTCCNO：C201373的杂交瘤细胞株分泌。2.分泌权利要求1所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCCNO：C201371或CCTCCNO：C201373。3.权利要求1所述的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体在制备用于检测癌症的存在和/或转移的检测剂或试剂盒中的应用，其中所述癌症选自白血病或肺癌。4.根据权利要求3所述的应用，其中通过权利要求1所述的单克隆抗体检测人外周血和肿瘤组织中上皮细胞粘附分子的表达来判断癌症的存在和/或转移。5.权利要求1所述的由保藏编号为CCTCCNO：C201373的杂交瘤细胞株分泌的特异性抗人上皮细胞粘附分子的单克隆抗体在制备用于抑制体内肿瘤生长和/或转移的药...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏海明，范晓蕾，郑小虎，田志刚，孙汭，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：