本发明专利技术涉及生物医药工程技术领域，公开了一种呼吸道合胞病毒(RSV)抗原蛋白F与抗体恒定区Fc的融合蛋白(F-Fc)的生产方法，及其作为RSV亚单位疫苗的用途。本发明专利技术首先利用分子克隆方法构建了含有RSV?F蛋白与人IgG1Fc融合蛋白的真核表达载体，转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，表达融合蛋白；采用Protein?A亲和层析，得到高纯度的融合蛋白；以CpG为佐剂，用融合蛋白滴鼻免疫BABL/c鼠，激起针对RSV的特异性粘膜免疫、体液免疫以及偏向于“Th1型”且“Th1/Th2平衡”的细胞免疫，有效抑制RSV感染。
Fusion protein of respiratory syncytial virus F protein and Fc and use thereof
The present invention relates to the technical field of Biomedical Engineering, and discloses a respiratory syncytial virus (RSV) antigen and F antibody constant region Fc fusion protein (F-Fc) production method, and use thereof as RSV subunit vaccine. The invention firstly by molecular cloning method constructed with RSV? F protein and IgG1Fc fusion protein eukaryotic expression vector, transfection China hamster ovary cells (CHO cells), the expression of the fusion protein; using Protein? A affinity chromatography to obtain high purity fusion protein; with CpG adjuvant for intranasal immunization with fusion protein BABL/c rats, arouse for RSV specific mucosal immunity, humoral immunity and tend to \Th1\ and \Th1/Th2\ the equilibrium of cell immunity, inhibit RSV infection.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药工程
，具体涉及呼吸道合胞病毒(RSV)抗原蛋白F与抗体恒定区Fe的融合蛋白(F-Fc)，及其作为RSV亚单位疫苗的应用。
技术介绍
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是在世界范围内存在并引起婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体之一，RSV感染可引起一系列的呼吸道疾病，从简单的感冒症状到严重的下呼吸道感染及并发症。RSV的首次感染多发生于2月龄的婴儿，感染率高达83%，而且感染后不会产生持久的免疫力，有50%的婴幼儿会在首次感染后的I 2年内再次感染。同时，RSV在青少年、老年人以及免疫缺陷人群中也是一种常见且严重的病原体。RSV属于副粘病毒科、肺炎病毒属的单股-负链-非节段性RNA病毒，其核心是核衣壳包裹的RNA，外层包被有出芽时来自宿主的脂质双分子层以及嵌合其中的跨膜蛋白。RSV的RNA共编码10种蛋白质:三个跨膜蛋白(G、F、SH)、两个基质蛋白(M、M2)、三个核衣壳蛋白(N、P、L)和两个非结构蛋白(NS1、NS2)。其中三种跨膜蛋白与免疫保护以及致病毒力密切相关，分别是粘附糖蛋白(G)、膜融合蛋白(F)以及小疏水蛋白(SH)。抗G蛋白抗体可以阻止RSV向宿主细胞的吸附，抗F蛋白抗体可以阻止RSV与宿主细胞融合，这使得G蛋白和F蛋白被认为是RSV的主要抗原。最新的研究显示，F蛋白是RSV的最重要的保护性抗原，它是保护性中和抗体的重要靶位点，同时也有证据表明，F蛋白还是⑶8+T细胞的一个重要靶位点。G蛋白有一个疏水的N末端，通过该N末端把G蛋白锚定在病毒脂质包膜上。同时，G蛋白还存在另外一种分泌型G蛋白，分泌型G蛋白缺少了N末端的65个氨基酸残基，只 保留高度糖基化的胞外区，分泌型G蛋白有可能导致免疫应答向Th2方向发展。众所周知，疫苗是防控传染病的最有效的手段，但至今还没有被批准的疫苗用于RSV免疫防治。在上世纪70年代，美国首次推出福尔马林灭活RSV疫苗(F1-RSV疫苗)，并接种2 7个月的婴幼儿，有80%的婴幼儿出现了病情加重，而且有2例死亡，发现死者肺部出现了大量的嗜酸性粒细胞浸润和炎症因子，使得Thl/Th2平衡紊乱。进一步研究表明F1-RSV引起了过高的Th2免疫应答，造成⑶4+T细胞激活和增殖后分泌一些炎症与趋化因子，加速了肺部的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的产生和浸润，并产生低亲和力的针对G蛋白等的保护性抗体。F1-RSV也损伤了 CD8+T细胞活性和功能，最终导致RSV清除过程缓慢、肺部损伤及病毒大量传播，F1-RSV疫苗以失败而告终。因此，寻找新的技术策略，是研制安全、有效RSV疫苗的重要任务。目前，国内外学者开展了温度敏感型RSV弱毒疫苗、携带RSVF蛋白的重组人/牛副流感病毒活载体疫苗、重组RSV F蛋白的亚单位疫苗及佐剂与免疫途径等一系列研究，其目的是诱导更强的保护性中和抗体，改变免疫应答类型。抗体的新生受体(neonatal Fe receptor,FcRn)广泛分布于上皮细胞、内皮细胞、抗原递呈细胞等细胞表面，其主要作用是:与抗体Fe结合后，保护抗体免于降解、延长抗体半衰期，将抗体从母体通过胎盘转运至胎儿。本专利技术将RSV抗原蛋白F与抗体恒定区Fe融合，形成F-Fc融合蛋白，滴鼻免疫后，融合蛋白F-Fc通过Fe与FcRn结合,随FcRn的迁移将融合蛋白转运至体内；通过抗原递呈细胞将抗原F递呈至免疫细胞，从而有效地激活粘膜免疫、体液免疫以及偏向于“Thl型”并且“Thl/Th2平衡”的T细胞免疫，有效抵抗RSV感染。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是:提供一种RSV抗原蛋白F与抗体恒定区Fe的融合蛋白(F-Fc)的制备方法，及其作为RSV亚单位疫苗的应用，克服福尔马林灭活疫苗(F1-RSV疫苗)免疫后产生低中和活性抗体以及偏向Th2型免疫应答的弊病。本专利技术解决技术问题采用以下的技术方案:本专利技术提供的一种融合蛋白F-FC，是一种呼吸道合胞病毒抗原蛋白F与抗体恒定区Fe的融合蛋白，该蛋白含有RSV的F蛋白与人IgGl恒定区Fe片段，其中编码RSV F蛋白的基因序列为SEQ ID NO:1，氣基酸序列为SEQ ID NO:2 ;编码抗体IgGl恒定区Fe片段的基因序列为SEQ ID NO:3，氣基酸序列为SEQ ID NO:4。所述编码该蛋白的基因序列为SEQ ID NO:5，氨基酸序列为SEQ ID NO:6。本专利技术提供的上述呼吸道合胞病毒抗原蛋白F与抗体恒定区Fe的融合蛋白，其通过以下方法得到:首先构建含有SEQ ID NO:5基因序列的真核表达载体，然后转染CHO细胞，表达该融合蛋白，最后采用ProteinA亲和层析,分离得到。 本专利技术提供的上述呼吸道合胞病毒抗原蛋白F与抗体恒定区Fe的融合蛋白，其用作RSV的亚单位疫苗。所述的亚单位疫苗,是一种滴鼻液药品，该滴鼻液药品可激起针对RSV的特异性粘膜免疫、体液免疫以及偏向于“Thl型”并且“Thl/Th2平衡”的T细胞免疫，用于预防RSV的感染。术语“融合基因”是指利用DNA重组技术将两个不同的基因拼接起来的组合基因。术语“融合蛋白”是指利用DNA重组技术得到的两个不同的基因组合后的表达产物，即融合基因的表达产物。术语“Thl偏爱性免疫应答”特征在于生成IL-2和IFN-Y的⑶4+T辅助细胞占优势，分泌或存在IL-2和IFN- Y。比较而言，“Th2偏爱性免疫应答”特征在于生成IL-4、IL-5和IL-13的⑶4+T辅助细胞占优势。本专利技术与现有技术相比，具有以下的主要突出效果和优点:本专利技术的创新在于将RSV抗原蛋白F与抗体效应区Fe融合，构建成融合蛋白F-Fc,形成抗原-抗体复合物。融合蛋白F-Fc含有的抗体效应区Fe与分布于鼻腔粘膜、呼吸道粘膜等处上皮细胞的Fe新生受体(FcRn)结合，利用FcRn将F-Fc转运到体内；随后，Fe与分布在粘膜层下的抗原递呈细胞表面的Fe受体(FcRs)相结合，将抗原F呈递至免疫细胞，激活免疫应答。本专利技术提出的这种新型融合蛋白F-Fc，是一种RSV抗原与抗体的复合物，作为RSV的亚单位疫苗应用，具有以下几个优点:首先，因为融合蛋白F-Fc利用分布于鼻腔粘膜、呼吸道粘膜等处上皮细胞的Fe新生受体(FcRn)之间的相互作用而转运至体内，所以可经粘膜途径，进行滴鼻免疫，不需要进行注射，是一种无针疫苗(no-needle vaccine);其次，融合蛋白F-Fc与抗原递呈细胞表面的Fe受体结合，将抗原F呈递至免疫细胞，刺激机体产生针对RSV的特异性抗体IgA (图2-图4)，激活粘膜免疫；同时，刺激机体产生针对RSV F蛋白的的特异性中和抗体IgG(图5)，激活体液免疫；第三，与福尔马林灭活疫苗相比，最大优势在于融合蛋白F-Fc激活的细胞免疫产生较多的IFN-Y和IL2，较少的IL4(图6)，更偏向于“Thl型”，不引起免疫后病毒感染增强。附图说明图1为用免疫印迹(WesternBlot)检测CHO细胞表达的融合蛋白F-Fc和重组蛋白F。图2为用F-Fc、F和PBS混合佐剂CpG免疫小鼠，第三次免疫2周后，检测小鼠唾液中的IgA抗体滴度(5只小鼠的均值)。图3为用F-Fc、F和PBS混合佐剂CpG免疫小鼠，第三次免本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白F?Fc，其特征是一种呼吸道合胞病毒抗原蛋白F与抗体恒定区Fc的融合蛋白，该蛋白含有RSV的F蛋白与人IgG1恒定区Fc片段，其中编码RSV?F蛋白的基因序列为SEQ?ID?NO：1，氨基酸序列为SEQ?ID?NO：2；编码抗体IgG1恒定区Fc片段的基因序列为SEQ?ID?NO：3，氨基酸序列为SEQ?ID?NO：4。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖庚富，祖向阳，龚睿，张哲，周拯，王薇，王宗林，金卉，侯政，刘海滨，刘洋，徐婷，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：
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